5 蛋白质的定性定量分析及保存演示教学.ppt

在SDS中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式： lg Mr＝lgK－bm＝K1－bm 其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。 注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移 在半对数坐标纸上做出标准曲线 注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。 2. 凝胶过滤层析法测定分子量 蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg Mr＝K1－K2 Ve 在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。 SDS与凝胶过滤法是互补的 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量； SDS测得的是蛋白质亚基的分子量； 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。 例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS（不加还原剂）结果：45kD SDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD） 则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。 3. 质谱法是最精确的分子量测定方法 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。 由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。 第三节 纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存 一、 蛋白质的浓缩 超滤法 使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。 常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。 冷冻干燥法 在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。 注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。 吸收法 采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。 沉淀法 硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。 5.其它方法 浓缩胶浓缩法 离子交换法 吸附法 蒸发法 二、 蛋白质的干燥 常压吸收干燥 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 三、 蛋白质的保存 影响蛋白质成品保存的因素： 1）空气 2）湿度 3）水分 4）光线 5）pH值 6）时间 2.蛋白质的保存方法 低温下保存 制成干粉或结晶保存 在保护剂下保存 a.惰性的生化或有机物 b.中性盐 c.巯基试剂 第四节 蛋白质组学定量研究常见方法 蛋白质组学定量研究常见方法 1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC 1：双向电泳 基于2D的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分离：蛋白质经过2D分离后染色（银染、考染等）。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。 2：DIGE 简介： DIGE — 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。 技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大； 4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。 2：DIGE DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。 2、蛋