构建表达载体的实验流程及其注意事项2014-12演示教学.ppt

构建表达载体的 实验流程及其注意事项 中国农业大学 梁荣奇 2 把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体 注意事项： -- 选择合适的载体 -- 载体具有适合的酶切点 -- 适合地连接反应 -- 选择适合扩增质粒的菌株 -- 筛选、验证目的克隆 -- 转化对照 3 分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践，却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若一着不慎，即会陷入困境。 验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。 ——第一版前言（p11） 《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社 4 汇报内容 1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测 5 如何阅读质粒图谱 1、质粒类型和大小（真核/原核/穿梭质粒） 2、复制起点（ori） 3、筛选标记（抗生素标记） 4、多克隆位点（MCS） 5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位点） 6、表达系统元件 （启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号） 6 7 8 1、杀菌机理： 四环素（tet): 四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。 Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合 并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。 氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。 Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。 卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。 卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。 2、溶液配制： 一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。 常用抗生素抗性基因 10 候选基因功能分析 一、超表达载体 1、CaMV 35S启动子； 2、玉米Ubi启动子； 3、其它。 二、RNAi载体 1、含有intron，转录后形成发卡，沉默效率高； 2、 多用其本身启动子。 11 汇报内容 1 载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测 12 一、克隆位点的选择 1、首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。 2、然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。 二、保护碱基数（直接酶切PCR产物） 1、在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基。 2、 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行； 有些则加3个以上，NdeI就属这类，需加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。 13 目的基因获得 一、从已有载体上截取 所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点 二、PCR法 1、 无内含子，可用基因组DNA为模板，有内含子则用cDNA。 2、若PCR难度很大，宜将PCR产物连到克隆载体上，测序后，再酶切连接到表达载体上。不推荐直接酶切PCR产物。 3、在加loading buffer前，可取出几微升，作为二扩模板。 4、设退火温度梯度，多做几管。回收时损失大半。 5、尽管PCR产物只有一条特异带，电泳挖取目标带也是必要的。 三、人工化学合成 最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。 14 汇报内容 1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测 15 基因工程所用的酶 注意： 1、不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的； 2、同一公司的酶，使用相同的缓冲液或不同的缓冲液而 不显著影响酶活性时，可同时做双酶切。 3、一种酶可能有几种缓冲液。 CCCGGG GGGCCC Sma I 16 酶的质量标准 酶活单位：酶量，时间 酶的浓度：10 units/uL; 20 uints/uL等 保存条件: -20～-30 ℃ 切割位点：有无其他活性 酶切体系: buffer及与其它酶双切的buffer等 所用底物： DNA量，切后再连接的程度 反应温度：一般为37℃,但许多酶对温度有特殊要求 甲 基 化：