基础医学免疫组织化学技术.pptVIP

概 述 免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。 2．发展简史 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。——建立免疫荧光技术。 60年代 Nakane铁蛋白标记Ab,用酶代替荧光素来标记抗体的方法 ——建立酶标抗体技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术——建立辣根过氧化物酶-抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。当今使用最为广泛 1975年建立单克隆抗体技术。 80年代 Hsu 等建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。 适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。 7．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分为： ① 贴片染色 ② 漂浮染色 7．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式 （2）根据Ag-Ab结合方式分为： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 7．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分 （2）根据Ag—Ab结合方式分 （3）按标记物的性质分为： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法） ④放射免疫自影法 8．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag-Ab结合后形成的“免疫复合物”在一般光学条件下是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 因此先在已知抗体(或抗原)上连接一些可以用光镜观察到的显示剂，经过特定化学反应，最后“免疫复合物”显示不同颜色。在普通显微镜、荧光显微镜下能通过观察组织细胞特定部位颜色变化来找出疾病的特征性表现。 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素： 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素 ② 酶 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素 ② 酶 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素 ② 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 ） ③ 生物素（Biotin） 8．标记物 （1） 必要性 （2）常用标记物 ① 荧光素 ② 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 ） ③ 生物素（Biotin） ④ 铁蛋白金（主要应用于免疫电镜 ） ⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护困难,一般不用） PBS（磷酸盐）缓冲液 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液 3%过氧化氢溶液 DAB显色系统 0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0） 1mol/L的TBS缓冲液 酶消化液 3%甲醇-H2O2溶液 封裱剂 TBS/PBS PBS（磷酸盐）缓冲液（pH7.2～7.4）： 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液 3%过氧化氢溶液 DAB显色系统： 0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）： 1mol/L的TBS缓冲液 酶消化液 3%甲醇-H2O2溶液 封裱剂 TBS/PBS 3.组织的前期处理 固 定 固 定 脱蜡和水化 抗原修复 免疫组织化学染色 脱蜡和水化 抗原修复 免疫