分子生物常用技术未修改 课件.pptVIP

Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 二、 cDNA噬菌粒文库 基因文库的类型 基因组文库：由某种生物体总染色体DNA组成的文库。 cDNA文库：代表特定细胞或组织中mRNA的文库。 一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementary DNA，cDNA）。 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 高质量mRNA的制备 反转录生成cDNA 与噬菌粒载体分子相连接 噬菌粒的包装 建立cDNA噬菌粒文库的主要步骤 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 1、高质量mRNA的制备 用试剂盒提取总RNA 加入与生物素相连的寡聚(dT)引物温育 加入与微磁球相连的抗生物素蛋白 用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA 洗脱得到mRNA Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 2、反转录生成cDNA 以寡聚dT或随机6核苷酸为引物 反转录酶 cDNA第一链 以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链 加接头准备与载体连接 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 为了得到有方向性的cDNA应该接上不同的接头 加入带有酶切位点的寡聚dT引物 高活性的反转录酶 合成cDNA的第一链 合成cDNA第二链 用RNase H分解RNA链 加Eco RI接头 用Xho I内切酶切割 得到双接头有方向性的cDNA (5C↓TCGAG) Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 3、与噬菌体载体分子相连接 带有接头的cDNA 噬菌粒DNA 经内切酶切割 含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 4、噬菌粒的包装 含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA 体外蛋白质外壳的包装反应 有侵染和复制能力的成熟噬菌体 进行基因组学的研究 含有某种组织或器官的噬菌粒文库 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 目的基因筛选 南京农业大学 生命科学学院 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 基因敲除技术 1. 基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一 个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打 靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点。 * * 南京农业大学 生命科学学院 1. 基本原理 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母 细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常 用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛。 * * * 南京农业大学 生命科学学院 * * 用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 南京农业大学 生命科学学院 * 南京农业大学 生命科学学院 * 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk) Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 蛋白质样品 电泳 非标记抗体（一抗）发生免疫反应 荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应 通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分 转膜（硝酸纤维素薄膜） 方法： Western Blotting Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 Molecular Biology 生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室 * * 2. 蛋白质印迹法 用于二级抗体的检测有以下三种： 放射性标记的抗体 与酶