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2009.7.29 0 透析工作图 半透膜原理 渗透压的平衡 图 7-6 利用压力和离心力的超过滤 滤膜 抽气 施加外力 利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤(超滤)。 解决的是有或无的问题，未能解决大小的问题！ (二)凝胶过滤——分子排阻 根据分子大小分离混合物最有效的方法之一 多孔网状结构（微孔） 交联度（孔度） 凝胶珠（颗粒） 凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fractionation range） Sephadex G-50 排阻极限是30 000 排阻极限（exc1usion limit）来表示分级分离范围的上限，它被定义为不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的Mr Sephadex G-75 排阻极限是70 000 分子筛层析 按照分子量大小分离开 在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响 离子强度（I） Log（溶解度） 盐溶：中性盐低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度。 盐析：当蛋白质溶液的离子强度增加到一定强度后，很多蛋白质可以从溶液中沉淀下来。 (三) 盐析和有机溶剂沉淀 向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。 常用的中性盐： 不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。 硫酸铵、 硫酸钠、 氯化钠等 概念： 特点： 作用原理: 水化层脱水，表面疏水基团暴露并相互作用引起聚集 (三) 盐析和有机溶剂沉淀 (2) 有机溶剂沉淀法 降低溶液的介电常数：使蛋白质表面可解离基团的离子化程度减弱，有机溶剂脱去水化层，致蛋白质分子聚集而沉淀。 必须在低温下操作 注意事项: 尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去 甲醇、乙醇、丙酮 缺点： 原理 常用有机溶剂: 常会使蛋白质变性 介电常数大的溶剂，有利于离子对的解离。 80－30 （四）电 泳 概念： 带电颗粒在电场中向着所带电荷相反 方向 移动称为电泳。 电泳 影响泳动速度的因素： A、电荷多少 B、分子形状大小 C、电场强度 区带电泳 根据支持物的物理性质分为： ①滤纸电泳和薄膜电泳 ②粉末电泳：淀粉、纤维素功硅胶粉等 ③细丝电泳：人造丝、尼龙丝等细丝支持物上的电泳 ④ 凝胶电泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶 　　指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带 水平式平板凝胶电泳 垂直式平板凝胶电泳 SDS-凝胶电泳谱 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关 测定单体蛋白质分子量 等电聚焦（IEF）电泳 蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行的 pH梯度制作一般利用两性电解质在外电场作用下，自然形成pH梯度。 毛细管电泳 电泳是在微内径管(一般为50um内径和300um外径)中进行 记录仪 毛细管 层析种类： 凝胶过滤（分子筛） 离子交换层析（阴离子和阳离子） 亲和层析 (五) 层析 带正电荷多蛋白紧密结合 带负电荷多蛋白流过层析柱 阳离子交换树脂工作示意图 亲和层析工作示意图 蛋白质 载体介质 配体 结合 洗脱 洗脱介质 三、蛋白质相对分子质量的测定 凝胶过滤法测定相对分子质量 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 根据化学组成测定最低相对分子质量 如：肌红蛋白的含铁量为0.335%，计算肌红蛋白的最低分子量。 凝胶过滤法测定相对分子质量 利用凝胶过滤（gel filtration）可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。这种方法比较简便，不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径 YOUR SITE HERE 第7章 蛋白质的分离、纯化和表征 * * 主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力 第7章 蛋白质的分离、纯化和表征 三、蛋白质相对分子质量的测定 　一、蛋白质的重要性质 二、 蛋白质的分离纯化 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 　一、蛋白质的重要性质 1、 两性解离性质及等电点 2、 蛋白质胶体性质 3、 蛋白质的沉淀 4、 蛋白质的变性与复性 5、 蛋白质的紫外吸收特性 6、 蛋白质的呈色反应 1.蛋白质的两性解离性质 蛋白质分子除两端的氨基和