肠道病毒感染病例标本的处理、细胞接种和观察 课件.pptVIP

肠道病毒感染病例标本的处理、细胞接种和观察;人肠道病毒简介和分类;电镜下的病毒形态;病毒特性;人肠道病毒传播方式;病毒的组织培养;实验室检测方法; 病毒分离;细胞培养分离方法;标本的采集;（四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （六）病例密切接触者的标本采集：选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。 （七）健康对照的标本采集：选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。 ;手足口病;手足口病发病机理;用于病毒分离和鉴定标本的种类;标本的处理;B)粪便标本处理操作步骤：生物安全柜中操作 将离心管上标记标本号; 每一管中加入10ml 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿; 在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号一致），剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于-20℃。 拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20分钟。 将离心管上标记标本号;用冷冻离心机离心1500g*（约3500转）20分钟。 将每一份标本上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理一次）。 将一管粪便悬液冻存于-20℃作为备份，另一管存于4-8℃以备接种（用于当天接种细胞）。;2、脑脊液标本的处理---通常直接用于病毒分离。 3、疱疹液标本的处理---通常直接用于病毒分离。 4、咽拭子标本的处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后4℃条件下10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，用滤器过滤除菌。 5、眼结膜拭子标本的处理同咽拭子标本的处理。;病毒分离;B）操作步骤： ⑴显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成； ⑵倒掉（GM），换上1~1.2ml（MM）； ⑶每一份标本同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）； ⑷每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； ⑸每支试管接种0.2ml标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本病毒分离，尤其是EV70，强烈建议降低培养温度，一般可为35℃）； ⑹使用倒置显微镜逐日观察并如实记录细胞培养管的变化，至少一周。包括记录： CPE（1+~4+）： （1+，25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%）； 细胞毒性反应; 细胞老化或污染. ⑺关于肠道病毒CPE：即有特征性的肠道病毒致细胞病变效应，表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加， 折光性增强至细胞从管壁脱落。 ;⑻如果有特征性的肠道病毒CPE出现至观察到75%的细胞发生变化（3+ CPE），冻存于-20℃以备二次传代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定； ⑼第1代培养见可疑CPE至观察满7天后再继续冻融传代，待CPE稳定出现后-20℃或-70℃冻存以备进一步鉴定； ⑽如果7天之后没有CPE出现，需盲传2代继续观察。（注意：同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传代）； ⑾盲传2代后仍不出现CPE，则判定为阴性； 注意：盲传不可超过3代。 ;相关概念;HFMD结果解释;需要注意的两个问题;正常的RD细胞(人胚胎横纹肌肉瘤细胞，形态学为纺锤形及巨型多核细胞）;EV71T和CA16出现的CPE（接种后第7天）;正常的Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞，形态学为上皮样细胞）;CA24和EV70出现的CPE（接种后第7天）