医学分子生物学-上课用-9.基因功能研究的最基本策略.pptVIP

4）精子载体法 外源 DNA 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物 共育法 脂质体转染法 电穿孔法 DNA 精子 受精卵 DNA 卵细胞 DNA 胚胎干细胞 DNA 逆转录病毒感染 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 微注射 显微注射 3. 下游—基因整合与表达检测及筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平。 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。 鉴定方法 PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot 基因转移鼠纯合鼠系的建立 × 转基因杂合鼠 未转基因鼠 生殖系细胞中不含转入基因 生殖系细胞中含转入基因 子代多次交配可得到纯合转基因鼠系 分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。 建立人类疾病的转基因动物模型。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。 三. 转基因动物的应用 1. 人类疾病的转基因动物模型 各种人类遗传病的鼠模型，如： 老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、 关节炎(arthritis)、 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 肿瘤发生(tumorigenesis)、 高血压(hypertension)、 神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 动脉硬化症及其他很多疾病。 2. 利用转基因动物反应器生产药用蛋白 转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器 抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。 β乳球蛋白 红细胞生成素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 生长激素 3. 转基因改良移植器官 改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。 1997 年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。 4. 动物的克隆 1996 年，首次实现动物的无性生殖。 由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。 核移植技术（Nuclear Transfer) 核移植技术（Nuclear Transfer) 第二节 基因打靶 基因打靶(Gene Targeting) ：通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。 基因敲除(gene knockout): 删除靶基因的重要功能区，使靶基因失活。 基因敲入(gene knockin): 将外源基因整合到特定靶位点，进行特异性表达。 一、基因打靶的基本程序 打靶载体的构建。 打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。 基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。 胚泡植入假孕小鼠的子宫。 嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。 1. 打靶载体的构建 同源基因片段 质粒载体 HB1 HB2 neor基因 HSV-tk基因 2. 打靶载体导入ES细胞 磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 脂质体转染法 显微注射法 （1）打靶载体的正-负选择 与整合位点两端区域同源的两段 DNA 序列(HB1和HB2)。 目的基因。 编码抗 G418 的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。 2个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分别来自I 型II型单纯疱疹病毒。 打靶载体的正筛选 tk1 HB1 neor HB2 tk2 载体 载体 同源重组 neor G418正筛选，细胞存活 染色体 染色体 打靶载体的负筛选 tk1 HB1 neor HB2 tk2 染色体 染色体 非特异性整合 GCV负筛选，细胞死亡 （2）PCR 鉴定 在打靶载体的 HB1 和 HB2 之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA 序列（US）。 如发生随机整合，PCR 无法扩增出预期的DNA 片段。 如果整合于特定位点时，则 PCR 可以扩增出预期大小的片段。 PCR 鉴定：特异整合 tk1 HB1 US neor HB2 tk2 P2 P1 PCR反应有特异条带 特异整合 3. 基因敲除小鼠的获得 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫 嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。 × 第三节 基因沉默 在RNA水平上研究基因功能的方法： （一）反义RNA （二）RNA干扰技术 （二）RNA 干扰 1990 年，Jorgense