基因工程第4篇章 目的基因的制备.pptVIP

6学时 教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。 第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离;第一节 目的基因的制备 一、直接分离法 1、限制性核酸内切酶酶切分离法 已知序列基因. 酶切后分离 与适当载体重组 转入受体。;plasmid;2、物理化学法 密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。 单链酶解法：G C间三键，A T间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。 分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。 是基因在发展初期所用的方法 ;3、双抗体免疫法 蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。 mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。 分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。 分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。;;去蛋白提取RNA，反转录合成cDNA;二 构建基因组文库;2、基因文库的大小;;3、构建λ噬菌体基因组文库的步骤;切割方法： 物理学方法：机械力和超声波。 生物化学法：酶切 为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。 如Sau 3AI或Mbo I等切后的片段可直接与BamH I酶切的载体连接。 切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。;与λ噬菌体克隆载