第4章节 蛋白质的共价结构.pptVIP

三、蛋白质一级结构的测定 什么是Pr的一级结构？ 蛋白质中氨基酸的排列顺序。 1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量 前提 （一）、蛋白质测序策略 (1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 蛋白质一级结构的测定 （一）、蛋白质测序策略 (2) 多肽链的拆分 蛋白质一级结构的测定 （一）、蛋白质测序策略 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 蛋白质一级结构的测定 （一）、蛋白质测序策略 (3) 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 蛋白质一级结构的测定 （一）、蛋白质测序策略 蛋白质一级结构的测定 (4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比 （一）、蛋白质测序策略 (5)分析多肽链的N-末端和C-末端 (6)多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。 蛋白质一级结构的测定 （一）、蛋白质测序策略 (7)测定每个肽段的氨基酸顺序 蛋白质一级结构的测定 (8)确定肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。 （一）、蛋白质测序策略 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。 蛋白质一级结构的测定 两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 （二）、末端氨基酸残基测定 Sanger法 1、 末端分析 ? 二硝基氟苯（DNFB）法 O 2 N F N O 2 + H 2 N C H C R O H N C H C R O O 2 N N O 2 H + H 2 O O 2 N N O 2 H N C H C R O O H + 氨基酸 DNFB N-端氨基酸 DNP衍生物 DNP-氨基酸 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 N 碱性条件 二硝基苯衍生物 黄色 二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 ? 丹磺酰氯（DNS）法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N (DNS-aa) ?苯异硫氰酸酯（PITC)法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N —N=C=S + N—CH—COOH H H R PITC —N—C—N—CH—COOH H H R S PTC-氨基酸 —N—C H R S N C C O PTH-氨基酸 pH8.3 无水HF 苯异硫氰酸酯PITC 肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量， 按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 —水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。 ④氨肽酶法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N 肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质 ① 肼解法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 2 C （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 2 C C末端AA α氨基醇 ② 还原法 硼氢化锂 肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 ③羧肽酶法 （二）、末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 2 C （三）、二硫键的断裂 盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 1、酸水解 （四）、氨基酸组成的分析 2、碱水解 第4章 蛋白质的共价结构 蛋白质 （Protein） 1838年，J. J. Berzelius提出，由proteios衍生而来 ——第一重要，首要的物质 蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。 一、蛋白质通论 （一）、蛋白质的化学组成和分类 １、元素组成 ２、