第5章节 发酵菌种的制备.pptVIP

二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂（P103） 诱变剂 物理：紫外，快中子，射线，激光 化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（NTG） 生物：噬菌体，转座子 1.5 发酵高产菌种的选育 （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择 （一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。 压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH 二、诱变育种 （三）、诱变育种的一般步骤 （P103） 二、诱变育种 诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。 诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。 筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。 诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高产菌株。 （三）、诱变育种的一般步骤 二、诱变育种 出发菌株的选择 制备菌悬液 诱变处理 突变菌株的筛选 营养缺陷型突变菌株的筛选 抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛选 组成型突变株的筛选 抗性突变株的筛选 自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 随机筛选 形态 理化性质 HD:高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶 AK:天冬氨酸激酶 结构类似物抗性：Lys的类似物AEC, Thr的类似物AHV 营养缺陷型：如Thr缺陷型 黄色短杆菌F9-50的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l F6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/l F9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l 三、基因的直接进化(directed evolution) 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传 步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 1.5 发酵高产菌种的选育 主要应用： 酶活性能的提高: 生理环境→工业催化环境 pH 温度 有机溶剂 底物专一性 脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯 例： PLA PLA光学拆分选择性(%) 2 31 57 75 81 90 5次错位PCR 2次定点突变 Reetz (1997) Liebeton(2000) 定点突变 错位PCR DNA改组(DNA Shuffling): 指DNA分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 DNA改组技术(1994)的发明人Stemmer博士，他以5项美国专利为技术支撑点，于1997年创立了专门从事DNA改组研究的公司Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 duPont公司、生产抗生素的世界巨头 DSM公司和工业酶研究生产之最的Novo nordisk公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美国国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)的5项资助，共计2100万美元。从另一角度反映了DNA改组的重要性及美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度。 图1　有性PCR法改组DNA的基本程序 DNA shuffling 图2　交错延伸法改组DNA的基本程序 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? DNA shuffling X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XX