三次连续提取DNA能较好反映土壤微生物丰度.doc

稳定性同位素示踪稻田土壤中甲烷氧化微生物核酸DNA/RNA研究郑燕1,2 贾仲君2( 1郑州轻工业学院，食品与生物工程学院，郑州 450002 2中国科学院南京土壤研究所，土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京 210008 摘要：稳定性同位素示踪复杂土壤中微生物DNA/RNA的技术难点是13C-DNA/RNA的鉴定。本研究针对我国六种典型稻田土壤，利用稳定性同位素13CH4示踪活性的甲烷氧化菌，超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA后，通过甲烷氧化菌独有的pmoA功能基因和16S rRNA特异基因作为分子标靶，评价了目标微生物特异基因作为分子标靶判定13C- DNA/RNA的可行性，并进一步通过半定量凝胶电泳技术和克隆文库技术研究好氧甲烷氧化过程中的活性甲烷氧化菌群落结构。结果表明：甲烷氧化菌功能基因pmoA作为分子标靶，能够准确鉴别13C-DNA，而甲烷氧化菌特异的16S rRNA基因则能较好地区分12C和13C标记的RNA但13C-RNA中的非目标微生物污染高于13C-DNA示踪技术。进一步以13C-DNA和13C-RNA为模板，分别构建了pmoA和RNA基因的克隆文库，系统发育分析表明I型菌主导了土壤甲烷氧化过程，其中江西鹰潭和黑龙江五常土壤中活性甲烷氧化菌全部属于Ia型，而四川资阳、浙江嘉兴、江苏常熟和江都土壤中Ia型和Ib型甲烷氧化菌均有发现，并且后者比例较低。这些结果表明分子标靶基因能够有效判定复杂土壤中的甲烷氧化菌13C-DNA/RNA，在DNA和RNA水平的结果基本一致，为进一步开展原位条件下活性甲烷氧化菌多样性与功能的研究提供了参考。 关键词： 稻田土壤；好氧甲烷氧化；稳定性同位素示踪DNA/RNA 中图分类号：Q938 文献标识码：A 文章编号： 甲烷是一种重要的温室气体，稻田是大气甲烷的重要源。据估算，稻田甲烷约占全球甲烷排放总量的10%[1]。微生物是稻田甲烷氧化的唯一生物源，在稻田甲烷排放过程中发挥了重要作用[2]，大约30%~90%稻田甲烷排放到大气前即被微生物氧化[3]。好氧甲烷氧化被认为是最主要的稻田甲烷氧化过程，主要发生在表层土壤大约0-2 mm的微氧界面、水稻根际以及根际土壤有氧微域中[4-5]。 目前已知的甲烷氧化菌属于变形菌门Proteobacteria和疣微菌门Verrucomicrobia，但疣微菌门Verrucomicrobia只存在极端酸性环境中存在，迄今未有稻田生态系统的相关报道[6]。根据形态、代谢途径、GC含量、磷脂脂肪酸组成以及细胞膜结构等特征，已知的稻田甲烷氧化菌可分为（type I）和（type II），其中I型菌可划分为Ia（type Ia）和Ib（type Ib）类群[7]。近年来，基于DNA/RNA序列分析的技术在稻田甲烷氧化研究中得到了广泛应用[8]，特别是颗粒状单加氧酶（Particulate methane monooxygenase，pMMO）基因pmoA，存在于除Methylocella之外所有的甲烷氧化菌，常被用于甲烷氧化菌多样性的分子生态学研究[8]。此外，由于pmoA基因的系统发育关系与甲烷氧化菌16S rRNA基因的系统发育亲缘关系与pmoA基本一致[9]，甲烷氧化菌的特异16S rRNA 基因也常被作为分子标靶开展生态学研究[8] 然而，以往的大多研究依赖于定性的线性耦合，即甲烷氧化速率与甲烷氧化微生物群落组成和数量变化之间的相关性分析[10-11]，很难将复杂土壤环境中甲烷氧化过程及其微生物作用者直接偶联。稳定性同位素核酸探针技术（DNA/RNA based stable isotope probing，DNA/RNA-SIP）则能有效地克服这一技术难点。2000年英国科学家发明了DNA-SIP技术，利用稳定性同位素示踪复杂森林土壤中甲醇同化微生物，将复杂环境中生态过程与微生物作用者直接联系[12]。RNA-SIP技术随后也被应用于工业反应器中苯酚降解微生物研究[13]。目前，DNA/RNA-SIP已被广泛应用于复杂环境中重要生态过程的微生物作用者研究，但两种方法各有其优势[14-15]。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物生理生长并驱动生态过程的最直接证据；同时，DNA较为稳定，可以同时分析16S rRNA基因和功能基因，在分子水平上鉴定生态过程的微生物驱动者。RNA-SIP则无需微生物细胞的大量增殖，同时核糖体RNA特别是16S rRNA参与蛋白质合成并发挥重要作用，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。但目前关于这方面的研究报道较少，DNA和RNA-SIP之间的比较优势仍待进一步深入研究。 我国稻谷产量世界第一，植稻面积世界第二，研究我国稻田土壤甲烷氧