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第二章 基因工程的酶学基础;一、限制性核酸内切酶;2. 性质;限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。;细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。;;I 型限制性内切酶 ;首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 ;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）;CTGCA?G ; ①连接便利 ;;③ 补平成平齐末端;识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’ ;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 ;;限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 ;;在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。;3. III类限制性内切酶 ;核酸限制性内切酶的类型及主要特性;;1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： ;4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。;DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 ;大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。;是影响限制酶活性的重要因素。;五、限制性内切酶对DNA的消化;内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。;只有有限数量的酶切位点被切开。 ;大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。;;6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表 ;;;;;;;;;从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。;（1）大肠杆菌连接酶;（1）必须是两条双链DNA。;1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。;;5. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。;连接酶反应的最佳温度是37?C。;增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。;第三节 DNA聚合酶;1. 共同特点;DNA聚合酶;三、DNA聚合酶在基因工程中的用途;① 底物：;标记;标记;③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记;5’?3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。;纯化的DNA片断;2. Klenow fragment;① 3’端补平;;③ cDNA第二链的合成;（1） T4 DNA聚合酶的性质;③ 特点;;（2） T4 DNA聚合酶的用途;酶切中间产生两个末端标记;a. 放射性标记的优缺点：;b. 非放射性标记;纯化的DNA片断;光促生物素标记;抗生物素蛋白（avidin）：;ii）地高辛标记：;;iii）偶联酶及其底物;化学发光底物;HRPO和AP的显色反应底物;发光反应机理;iv）用非放射性标记的探针检测原理;;4. T7 DNA聚合酶;（2）T7 DNA聚合酶的特点;② 进行末端标记 ;5. 修饰后的T7 DNA聚合酶;6. 逆转录酶;;（3）逆转录酶的用途;;第四节 DNA修饰酶;;4. 末端转移酶的用途;（2）再生酶切位点;;（3）非放射性标记DNA片断的3’端;二、T4多核苷酸激酶;;3. 多核苷酸激酶的用途;; 三、碱性磷酸酶;2. 碱性磷酸酶的特性;;;;第五节 核酸外切酶（ Exonucleases）;二、双链DNA外切酶;2. ?核酸外切酶（? exo）;3. T7基因6核酸外切酶 ;;第六节 单链DNA内切酶;3. S1核酸内切酶的功能;;4. S1核酸酶的用途;RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。;二、Bal 31核酸酶;4. Bal31的用途;与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。 根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。;;