分子生物学教学幻灯片7.DNA tech.ppt

;基因工程 genetic engineering 遗传工程 genetic engineering 基因操作 gene manipulation DNA 重组技术 recombinant DNA technique 基因克隆 gene cloning 分子克隆 molecular cloning ; 基因工程：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。;基因工程的理论依据： 遗传物质——DNA DNA双螺旋结构模型 操纵子学说 基因的表达与突变（中心法则） 基因工程的工具酶的发现;基因工程的基本程序： 分 — 切 — 接 — 转 — 筛基因工程技术的特点： 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。;基因工程的基本程序;; 中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长效应。;1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 多莉羊 英国爱丁堡罗斯林研究所 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程 ;克隆羊多利（Dolly）的诞生;;;;组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体;基因工程的主要技术; 克隆（clone） 无性繁殖 名词：从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。 动词：;基因克隆 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。;基因克隆示意图;;自然界的基因转移和重组;结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）。 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。;基因工程;工具酶;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖;;限制性核酸内切酶(restriction enzyme);识别和切割位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 ;粘性末端与平头末端;DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶;DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性;核酸外切酶活性;DNA 连接酶;;碱性磷酸酶的脱磷酸作用;;载体 vector;载体的基本要求： 1.复制单位; 2. 克隆位点(多个单克隆位点); 3. 筛选标记; 4. 分子量尽可能小; 5. 外源DNA插入后不影响载体本身的复制. 没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.; 质粒 plasmid  λ-噬菌体 λ- phage M13  柯斯质粒 cosmid ;;质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 ——理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS); * 大小 2~10kb； * 优点：易于操作、保存； * 缺点：转化效率较低，一般106-7 clone/1ug 转化方法：化学法 电转 * 应用：1. 小基因组的克隆 2. 单一序列的克隆( 目的基因的 克隆);pBR系列 来源于Psc