5章常用分子生物学技术(更新版)潍坊医学院课件.ppt

第 四 章;第 一 节 ; 聚合酶链反应（PCR）技术是1983年由美国Cetus公司的Kary Mullis建立的，是一种体外快速特异扩增已知序列的特定DNA片段的技术，能在数小时内将特定的DNA片段扩增100万倍。该技术的建立极大推动了生命科学的研究进展。Kary Mullis由于发明了PCR技术获得1993年诺贝尔化学奖。;基本反应步骤包括三步:; （3）延伸（extension）将温度升至72℃，1.5分钟，DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列DNA为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，从而形成新的双链DNA。;;5?;Cycle 3;二、PCR体系;（二）引物：;引物设计一般遵循的原则：; （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。为了扩增出单一的、特异性的DNA片段，所设计的引物序列不能在模板序列中重复出现。这就是所谓的引物序列的独特性。; （6）引物3′末端碱基：原则上要求引物3′末端与模板DNA一定要配对。另外引物3′末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶的延伸效率。引物3′末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发链的合成效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而末位碱基是T时，错配时引发效率大大降低。G、C居于中间，所以3′末端的末位碱基最好选T、C、G，而不是A。;（三）DNA聚合酶：; ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。; 与大肠杆菌DNA聚合酶Ι相比， Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶活性。因此，在PCR反应中如果发生某些单核苷酸的错配，这种酶是没有校正功能的。使用Taq DNA聚合酶的 PCR反应出现碱基错配的机率为2.1×10-4左右。在100μL反应体系中，一般需要Taq DNA聚合酶的用量为0.5~5U。酶浓度的选择主要根据扩增片段的长短及其复杂程度不同而有所区别。使用酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则合成产物量减少。; dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应用NaOH将pH值调7.0-7.5，分装小管，于-20℃存放。dNTP浓度应在20～200μmol/L，浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，浓度过低会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。如果其中一种dNTP浓度明显不同于其它几种时，就会诱发错误掺入，降低合成速率。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注意Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。;（五）PCR反应的缓冲液 ：; 1、变性：变性温度低时，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。; 2.退火：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物与模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基的组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于含20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度的起点较为理想。引物的合适复性温度可通过以下公式帮助选择　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。; 3.延伸：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用 温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一 般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够；3～4kb的 靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过 长会导致非特异性扩增带的出现。但是对低浓度模板的扩 增，延伸时间要稍长些。; 4.循环次数：循环次数决定PCR的扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数