生物制品的制备生物制品学教学课件精品.ppt

3、生物活性测定（measurement of bio-activity ） 是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。 重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。 体内生物活性的测定要建立适合的生物学模型。体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、3H-TdR掺入法和酶法细胞计数等。 4、稳定性检测（examination of stability ） 稳定性检测是评价药品有效性和安全性的重要指标之一。 5、产品一致性的保证 （ security of production consistency ） 五、产品的保存（conservation of production ） 1、液态保存（ conservation of liquid ） （1）低温保存：液态蛋白质样品在-10～-20℃以下冰冻保存比较理想。 （2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，因而保存液态蛋白质样品时，调到其稳定的 pH范围内。 （3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，保存时浓度不能太低，否则可能引起亚基解离和表面变性。 （4）加保护剂保存：加入某些稳定剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变性失活。 2、固态保存（conservation of solid ） 一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，在干燥器中在4℃以下可保存相当长的时间。 （ Fig1. Mechanism of AC） （Fig2. Mechanism of AC） 具有特异性亲和作用的生物分子 4）配基的种类 (sorts of ligand) 抗原与抗体。 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)。 酶与其底物（enzyme and substrate） 。 激素与其受体。（hormone and receptor） 维生素与结合蛋白 。（vitamin and binding-protein） 糖蛋白与植物凝集素。（glycoprotein and phytoagglutinin） 5）亲和层析载体的性质与选择 亲和层析载体的选择(selection of vectors) 多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 颗粒均匀，具有良好的流速。 具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 在温和的条件下 能与配基共价偶联。 6）常用的亲和层析载体： （Vectors of Affinity Chromatography） 纤维素（cellulose） 葡聚糖凝胶（Sephadex） 琼脂糖凝胶（Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶（(Bio-gel） 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它新型载体（Other gels） 7）亲和层析配基的选择 (Selection of ligand) 1.纯化对象和配基之间必须有很高的特异性和较强的亲和力。 2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性。 3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和 载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。 8）载体、配基、目的物的连接（Conjunction of vector、ligand and target material） 载体（Vectors or Matrix） + 配基（Ligand） + 目的物（target material） Fig AC relies upon a reversible highly  specific binding reaction. Fig Spacer arm principle A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand. Fig Principle of preparing AC media 9）亲和层析的基本操作方法： ①平衡（ Equilibration） 用平衡Buffer冲洗柱体，至基线平稳. ②样品上柱和冲洗： （Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择性的吸附，杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。形成杂质峰（见下图）。 ③洗脱（Elution） 选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来（见下图）。 （4）凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography） 以具有空隙