第二篇章 基因工程原理及其在食品工业中的应用.pptVIP

5.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶） 来源于小牛胸腺，分子质量为60KDa，是一种不需要模板的特殊的DNA聚合酶。 具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。 主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾。②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。 （三）连接酶、磷酸酶 1.T4噬菌体DNA连接酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，分子质量为68KDa。 具有一种活性：即催化DNA的5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA等。 主要用于：①连接带匹配黏性末端的DNA分子。②使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。 2.碱性磷酸酶 来源于大肠杆菌及牛小肠。包括细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。 具磷酸酶活性，催化去除5’磷酸的反应。底物为单链或双链DNA及RNA、dNTP。 主要用于：①在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA分子的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸，以防自身环化。 三、基因工程的载体 载体（vector）：携带外源基因进入受体细胞的运载工具。基因工程载体的特性: （1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。 （2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。 （3）DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。 （4）具有能够观察到的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。 载体的报告基因（标记基因）：基因工程中利用载体上引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来，这种具有标志意义的基因称为报告基因（reporter gene）或标记基因。 最常用的报告基因有抗药性基因（例如，抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素等抗生素抗性基因）， 此外，还有氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）、 β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、β-球蛋白基因和人生长激素基因等。 按照介导的作用目的，可将基因工程载体主要分为克隆载体和表达载体。 克隆载体：有一个松弛性复制系统，能使外源DNA在受体生物细胞中扩增复制。（例如，细菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯氏质粒载体） 表达载体：有一个受体生物细胞所要求的包括启动子序列在内的调控系统，能使外源基因在受体生物细胞中进行功能表达。（例如，Ti质粒、SV40猴状病毒） 按照导入的受体生物，一般可将基因工程载体分为大肠杆菌（原核细胞）载体、酵母载体、植物载体、动物载体等。 （一）大肠杆菌载体 1.质粒载体 质粒:指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质。 质粒拷贝数（plasmid copy number）：一种质粒在一个细胞中存在的数目。 （1）质粒的生物学特性 一般为双链的共价闭合环状DNA（ccc DNA），质粒分子的长度一般为1～200 kb。不同质粒的分子质量差异显著，小质粒的分子质量约为103KDa，仅能编码2～3种中等大小的蛋白质；而大质粒的分子质量可达105KDa。 （2）质粒的分类 根据复制控制类型：一般可将大肠杆菌质粒分为严紧型复制控制质粒和松弛型复制控制质粒。 严紧型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制同步，并与宿主蛋白质的合成有关，而与DNA聚合酶Ⅰ的活性无关。如果宿主蛋白质的合成终止，质粒与宿主染色体的复制也停止。每个宿主细胞中只能达到1至数个拷贝。 松弛型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制不同步，其与DNA聚合酶Ⅰ的活性有关，而与蛋白质的合成无关。当宿主蛋白质的合成终止时，质粒仍可复制。每个宿主细胞中的质粒拷贝数可达10～200个。 （3）质粒克隆载体的条件 ①分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上。 ②能插入、运载一定大小的外源基因。 ③在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制。 ④在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能。