生物技术制药-抗体制药.ppt

生物技术制药;第四章 抗体制药;第一节 概述;20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。 1975年：K?hler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。 单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，因此称为单克隆抗体。它是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。制备的一般流程见下图。;单克隆抗体和多克隆抗体的制备;用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。 单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 ;基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。 1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3，而且消除了鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。;第二节 单克隆抗体;;一、抗原与动物免疫;一、抗原与动物免疫;一、抗原与动物免疫;一、抗原与动物免疫;二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养;二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养;二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养;二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养;;二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养;三、筛选阳性克隆与克隆化;免疫酶技术：它是把抗原抗体的免疫学反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来，即把具??催化活性的酶类通过化学的方法和抗体(或抗原)结合起来成为酶标记物。这种酶标记物同时具有免疫学反应性和化学反应性，将其与待测的抗原或抗体结合，通过酶的活性降解底物呈现出颜色反应从而显示出该免疫学反应的存在。酶的活性与底物以及与显色反应呈一定的比例关系。显色越深，说明酶降解底物量越大，与酶标抗体(抗原)相检测对应的抗原(或抗体)量也就越多。 将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。;一般来说，免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫荧光法更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。 ;1、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附;三、筛选阳性克隆与克隆化;三、筛选阳性克隆与克隆化;四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定;四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定;五、单克隆抗体的大量制备;五、单克隆抗体的大量制备;六、单克隆抗体的纯化;六、单克隆抗体的纯化;续（2）离子交换法 在最适离子强度及pH条件下，以离子交换 层析分离单克隆抗体可以纯化25~100倍。 高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂适宜单克隆抗体的大规模纯化。 （3）亲和层析 多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化。 葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 IgG与蛋白A的结合与pH有密切关系，鼠源性单克隆抗体在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。; 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致