蛋白质的提取与相关分离纯化.ppt

*;*;*;*;*;*;*;羟基磷灰石 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。 ;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;聚焦层析也是一种柱层析。 流动相为多缓冲剂， 固定相为多缓冲交换剂。 ;聚焦层析的缓冲液也称多聚缓冲液，是一种两性电解质缓冲液，其性质与载体两性电解质相似，由分子量不等、多种组分的多羧基多氨基脂肪族同系物组成 多羧基多氨基脂肪族同系物在250nm有较大吸收，而再280nm吸收很低。在聚焦洗脱过程中最好选择280nm检测有效成分的出峰情况，否则干扰较大;瑞典Pharmacia公司出售的多缓冲剂有polybuffer96和polybuffer74两种。 这两种多缓冲剂分别在pH6～9和4~7范围内具有较强的缓冲能力(见图8-1); 如将它们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为4 ～ 9。 另外，pH8.0~10.5的两性电解质(pharmalyte)也具有多缓冲剂的性能。 在实践中如何选用多缓冲剂? 这须根据聚焦层析的pH梯度范围来决定。 ; 聚焦层析介质种类较少，主要以交联琼脂糖为载体，通过共价键将多氨基多羧基化合物偶联到琼脂糖凝胶载体上，这类介质具有琼脂糖介质的亲水性和大孔性的基本特征，具有两性电解质的聚焦作用和离子交换能力;*;;图8-2A离子交换层析梯度形成示意图;pH梯度的形成; 例如：当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时， 先用起始缓冲液平衡到pH9， 再用含pH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体， 这时，多缓冲剂中酸性最强的组分（阴离子） 与碱性阴离子交换剂结合，发生中和作用。 如： 基质--电荷基团+--OH- + H+Cl- 基质--电荷基团+ -- Cl- + H2O;;;2．蛋白质的行为 1）蛋白质所带电荷取决于它的等电点(pI)和层析柱中的pH值。 当柱中的pH值低于蛋白质的pI值时，蛋白质带正电荷，且与阴离子交换剂不结合。 2）而随着洗脱剂向前移动， 当蛋白质移动至环境pH值高于其pI值时， 蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 3）洗脱剂的通过，固定相中的pH值随着淋洗时间延长而变化。 蛋白质周围的环境pH值再次低于pI值时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。 ;蛋白质所带电荷取决于它的pI和层析柱的pH值; 4）随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行， 于是各种蛋白质就按各自的等电点大小，依次被洗下来，从而达到了分离的目的。 5）不同蛋白质具有不同的等电点， 它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的， 洗脱出来的先后次序是按等电点大小排列的（大的先，小的后）。 这一过程见图8-3。 ;; 3．聚焦效应 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。 如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。 从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到pHpI时被洗出(见图8-4)。 在前蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时， 后者将在洗脱液的作用下快速向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处(即前样品的缓慢迁移处)。 然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。 ;;*;二、 操作;样品中多缓冲剂的去除;三、 应 用;（一）、分离蛋白质;鸡蛋白组分pH