蛋白质的相互作用研究分析方法.ppt

两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。; 蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。;第三节 蛋白质的相互作用的研究方法;1. 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用;2.方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4oC摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4oC摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析;3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。 3) 对照实验的设计。;二、GST融合蛋白进行Pulldow实验;2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4oC 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立GST对照，反应均在4oC进行;三、Fluorescence resonance energy transfer;什么是FRET? 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。;3. 绿色荧光蛋白 60年代，Shimomura等首先从水母（Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。;Osamu Shimomura ;William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s;;Chalfie 将GFP基因转入大肠杆菌中。;Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。他还发现了红色荧光蛋白。; Roger Tsien 对GFP的机理作出了贡献。制造了很多GFP突变体。;GFPsequence MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK /2001/07/26/0726gfp_print.html /ccacad/zimmer/