第八章_目的基因的分离克隆.pptVIP

1、基因组DNA的片段化 随机片段可通过机械切割或限制酶局部消化产生。 机械切割可获得较为均一的随机片段，但片段不能 直接用于克隆，须经末端修饰，连上接头后产生粘性末端才可以； 限制酶局部消化可直接产生粘性末端，但片段的随机性较差。一般采用Sau3A I（和BamH I同尾酶） 在λ噬菌体载体上构建基因组文库 植物基因组文库构建技术流程 2、核基因组文库构建的技术说明 较理想的置换型载体有EMBL、3EMBL4、 2001等，能容纳23kb外源片段，具有Spiˉ正选择表型。 载体臂的制备：用两个靠近的限制酶进行双酶切，防止填充片段与臂的重新连接。 DNA插入片段的制备：控制反应时间及酶量；防止酶切后的片段重新连接；1）碱性磷酸酶除去5‘末端磷酸基团，2）Klenow酶的凹陷末端不完全补平。 三、cDNA文库构建 步骤： 细胞总RNA提取并分离纯化mRNA； 合成cDNA第一链； 将mRNA－DNA杂交分子转变成双链cDNA； 双链cDNA的修饰； 双链cDNA重组到载体上。 一）RNA提取及 mRNA的纯化 用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图 二）合成第一链cDNA oligo（dT）引导的cDNA合成法； 随机引物引导的cDNA合成法； 三）mRNA-DNA杂交分子变为双链cDNA 自身引导合成法：用碱处理使mRNA模板水解，从而导致第一链cDNA解离，并在其末端形成一个发夹结构，以此为引物合成cDNA第二链，用S1核酸酶切割除去发夹环结构。 置换合成法：大肠杆菌RNaseH能够识别mRNA－DNA杂交分子，将其中的mRNA模板消化成许多短片段，以这些mRNA短片段为引物，利用原来的cDNA为模板合成第二链cDNA，通过连接酶连接成完整的双链cDNA分子。 oligo（dG）引导合成法：在第一链cDNA分子尚未与mRNA模板分离之前，先在其3‘－末端加上一段oligo（dG）序列，然后通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子发生水解作用，回收全长的cDNA，以互补的oligo（dG）序列作引物引导第二链cDNA的合成。 cDNA合成过程 四）cDNA链的末端修饰 合成的cDNA克隆前要经末端修饰，使之能与载体的相应末端连接。 同聚物加尾：利用末端转移酶在DNA分子3‘－OH加上一系列同种脱氧核苷酸。一般采用cDNA加上oligo（dC），载体加上与之互补的oligo（dG）。 加接头：利用T4DNA连接酶将接头连接到cDNA平末端，（非平端可用Klenow补平），用限制酶进行消化，产生带粘性末端的cDNA。（此法须用甲基化酶对cDNA中的酶切位点进行保护或采用罕见的接头） 加衔接头（子）： 五）cDNA克隆载体 用于植物cDNA文库构建的λ噬菌体载体主要有λgt10、λgt11等 λgt10为免疫区插入型克隆载体，克隆位点位于cI基因内，可以通过清亮噬菌斑（重组型）和混浊噬菌斑（非重组型）进行筛选。文库用核酸探针筛选。 λgt11为 －半乳糖苷酶失活型载体。克隆位点位于lacZ基因内，可以通过蓝斑（重组型）白斑（非重组型）进行重组体筛选。文库即可用核酸探针筛选，也可用免疫学探针（抗体探针）进行筛选。 以质粒为载体构建cDNA文库 以λ噬菌体为载体构建的cDNA文库流程图 四、利用PCR技术构建植物cDNA文库 cDNA文库构建的起始信息物质是mRNA，植物细胞中mRNA含量较低，对于低丰度的mRNA，要通过富集或增大克隆数目来保证构建的文库中能含有所需克隆。 用PCR技术构建植物cDNA文库优点： 能够从极有限的起始材料中构建cDNA文库； 可以以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，且避免低丰度信息分子的丢失； 能够提高cDNA文库的完整性； 末端转移酶加尾法扩增cDNA 寡核苷酸衔接子法扩增cDNA 五、基因文库筛选方法 从文库中筛选目的基因的方法主要有：核酸杂交法；免疫学检测法；PCR筛选法等 核酸杂交法适用于大量群体的筛选，可同时快速筛选克隆数目很大的文库。 对已知部分序列的目的基因的克隆，使用按已知信息合成的寡核苷酸探针；分离植物同源基因时，可根据保守序列合成同源探针； 免疫学检测使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。抗体探针只适用于表达文库的筛选，且只能筛选出表达了的克隆。 PCR筛选法是通过混合克隆的PCR，以尽可能少的PCR反应次数从含成千上万个克隆的基因文库中筛选出目的（阳性）克隆。 基因文库PCR筛选的“反应池”示意图 第三节 mRNA差别显示技术分离差别表达基因 一般真核生物基因的总数是10万个左右，在生物的一定发育阶段或在某一类型的细胞中，大约只有15％的基因得到表达。 基因的差别表达是生物个体发育的不同阶