抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白雷普克的药学研究及抗肿瘤机理探索pdf.pdf

葛保胜 抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋自(雷普克)的药学研究和抗肿瘤机理探索 中科院海洋所博十论文 摘 要 基因重组别藻蓝蛋白(雷普克)为本实验室利用基因工程技术构建的海洋活 性蛋白 经过前期的开发证明，雷普克为一高效低毒的抑瘤因子，具有较大的开 发潜力 本研究对雷普克的药学资料进行了研究，并初步探讨了其作用机制。 1.根据基因工程药物研发要求，利用卡那抗性基因替换了原生产菌株的氨节 青霉素抗性基因，并采用平板划线法将雷普克生产菌株传代至100代，其生长速 度、抗生素抗性、限制性内切酶酶切图谱、雷普克表达水平等均无明显差异，显 示出较好的遗传稳定性。经测定三批雷普克的N端15个氨基酸序列均一致。 2.在原来小试发酵和纯化生产工艺的基础上，进行了放大生产，并进一步 优化补料速率和纯化工艺。放大后的生产工艺基本稳定，雷普克表达量占菌体可 溶性蛋白的41.3%,OD600达到78，纯化后雷普克纯度达到98%以上，生产规模 达到克级水平。进一步的药效学试验表明，雷普克对人肝癌SMMC-7721裸鼠模 型具有显著的抑制作用。 3.采用SRB法建立了雷普克体外活性检测方法，利用HPLC等技术对雷普 克的肤指纹图谱进行了分析，保证了样品批次之间的一致性，并对雷普克中的内 毒素、残余宿主蛋白等微量杂质进行了测定，进一步完善了雷普克质量检定体系。 4.抗肿瘤机理探索:初步的药理试验结果表明，雷普克无明显的体外细胞毒 作用;经体内给药可以促进T细胞的增殖，促进细胞因子IL-2和7-IFN产生。 采用脱氧核糖法测定显示，雷普克具有较强的轻自由基清除能力。提示免疫促进 和轻自由基清除能力有可能是雷普克抗肿瘤作用机制之一。 5.抗肿瘤活性验证:分别构建表达了6种重组别藻蓝蛋白亚基组分，进行 了体内活性筛选。结果显示，His-RAPC对5180实体瘤、小鼠H22肝癌和人肝癌细 胞株SMMC-7721裸鼠模型均显示出了较好的抑瘤效果，有望开发为新一代抗肝 癌创新药物。 本研究完善了雷普克药学资料，并初步探讨了其作用机理，为其作为抗肿瘤 一类新药的开发进一步莫定了基础. 关键词:重组别藻蓝蛋白(雷普克)工艺放大 质量控制 免疫促进 TI自由 基清除 抗肿瘤 蔺保胜 抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白(雷普克)的药学研究和抗肿瘤机理探索 中科院海洋所博 s论文 ThePharmaceuticalResearchandMechanismExplorationof RecombinantAllophycocyanin(rAPC) Abstract GeBaosheng MajoredinMarinebiology Directed勿Prof.QinSong Therecombinantallophycocyanin(rAPC)wasexpressedinourlab,and developedasanovelanti-tumordrug.Theanti-tumormechanismofrAPCwas studied,anddifferentallophycocyaninsubunitswereexpressedinEscherichiacoli toevaluatetheiranti-tumoractivitiesinvivo. Theampgenewasreplacedwithkancodingsequenceinexpressionvector pMAL-p2X/APCofrAPCaccordingtoChinesePharmacopoeia.Theconsturcted strainTBlcontainingpMAL-p2X/APChadbeensub-culturedseriallyto100` generationinKan*platetostudythehereditystabilityoftherecombinantplasmid Theresultshowedthattherewerenosignificantdifferencesingrowthrate,restriction enzymedigesti