发酵工程原理试验教学指导书生物与食品工程学院试验从.DOCVIP

发 酵 工 程 原 理 实 验 教 学 指 导 书 生物与食品工程学院 实验、从土壤中分离固氮菌 实验目的和内容目的：学习从土壤中分离好氧性自生固氮菌的方法 1.2内容：分离自生固氮菌2实验原理土壤中自生固氮菌的种类很多，包括有好氧性的自生固氮菌（Azotobacter）、厌氧性的固氮梭菌（Clostridium）、固氮蓝细菌和少数有固氮能力的放线菌等。自生固氮菌具有固氮能力，能在无氮培养基上生长繁殖。取H6.5以上的耕作土壤，经过适当处理后，加入到无氮培养基上，在合适的温度下培养34天，在平板表面就会出现褐色、粘稠、半透明的菌落。它们均属于好氧性自生固氮菌。最常见的是褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）和拜氏固氮菌（A.beijerinckii）。这两种菌非常相似，它们都能产生非水溶性色素，所以菌落常呈棕褐色。拜氏固氮菌产色素能力较弱，因此菌落呈浅褐色至浅黑色，但它能产生更多的粘性物质，随着培养时间的增加其菌落常呈粘糊状。有些固氮菌如维涅兰得固氮菌（A.vinelandii）的菌落也粘稠状，但菌落无色，并能产生水溶液性绿色色素。为了分离到不同种的固氮菌，可在无氮培养基中加入不同的碳源。加1%淀粉可促进褐球固氮菌的生长，而维涅兰得固氮菌则是该属中唯一能利用鼠李糖的固氮菌。如加入蔗糖并调H到5～6的范围时可促进拜氏固氮菌的生长。最后可根据需要挑取典型的菌落，在无氮培养基平板上经过数次划线便可得到纯种的单菌落。凡能在无氮培养基上生长的菌，并非全是固氮菌，土壤中有些微嗜氮细菌，在氮素养料极少的情况下也能生长。另外，当自生固氮菌良好生长之后，一些能利用固氮菌分泌物的非固氮菌也能在其周围生长。因此，在挑取菌落时必须仔细辨认。实验材料和用具试剂：阿须贝无氮培养基（葡萄糖10g，MgSO4·H2O 0.2g，K2HPO4 0.2g，KSO4 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO3 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0）器材：无菌培养皿、无菌研钵、恒温箱等4操作步骤1 采集土样 农田表层土（土壤溶液H不低于6.5），一般取样方法是，在所选择的耕地上如蔬菜地或花圃，随机的确定3～5个点，每点取土样，混合，装入牛皮纸袋带回。取土时，先铲去表层5左右的土层，然后采5～20深处的土壤。2 烘箱增殖：土样取回后置于20～30温箱中增殖培养2天备用。 3 接种土粒接种法：将镊子放酒精灯灼烧灭菌，然后夹取小米粒大小的土粒，点种于培养基表面。每皿接10～15粒。泥浆点种法：取10土样，放无菌研钵或无菌培养皿内。另取5mL无菌水，缓缓加入到土样中，边加水边用无菌玻璃棒搅拌。当泥浆能用接种环挑起时，立即停止加水。加水不能过量，防止泥浆太稀，无法挑起，影响接种。4 培养：将接过种的培养皿贴上标签，贴于皿底，倒置放恒温箱中（试管放试管架上，于28～30培养3～4天）。5观察：如试管中滤纸条上（与培养液接触部分）出现褐色菌落，即表示有自生固氮菌生长。 实验 微生物菌种保藏方法 (一)常规保藏方法 1目的 1.1了解菌种保藏的基本原理。  1.2掌握几种常用的菌种保藏方法。 2原理  菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。3材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面。 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3器具  用于菌种保藏的小试管(10*100mL)数支、5mL无菌吸管、lmL无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。4流程 斜面保藏→砂土管保藏5步骤  5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2～3 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37℃恒温箱中培养48h。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2砂土管保藏 5.2.1流程 制沙土管→灭菌→制菌液→