异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性-中国农业科学.PDFVIP

中国农业科学 2017,50(20):3860-3870 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.003 异源表达 irrE转基因烟草的耐盐耐旱性 赵雷霖，范鑫，聂星，梁成真，张锐，孙国清，孟志刚，林敏，王远，郭三堆 （中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081 ） 摘要：【目的】IrrE 是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白，主要通过修复强辐射等逆境条件下 DNA 损伤，提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的 irrE后导入烟草对转基因烟草耐 逆能力的提高，为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE 并合成基因；通 过酶切连接法构建 irrE植物表达载体；通过叶盘法转化烟草并 PCR 验证获得阳性转基因再生苗；通过实时荧光 定量 PCR（qRT-PCR）分析转基因株系中 irrE 的表达量；通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 IrrE 编码 蛋白；通过 NaCl 和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性，通过测定抗逆相关生理指 标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造，共优化了 241 个密码子；构建了高效 植物表达载体 GBI-IE；利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗，并通过 PCR 验证共获得 15 个独立 的转基因株系；通过 qRT-PCR 分析从中选取两个表达量最高的株系 GO1 和 GO2 进行后续的抗逆性分析；Western blot 验证 IrrE 编码蛋白在 GO1 和 GO2 中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析：种子萌发试验表明，正常 1/2 MS 培养基上，转基因株系 GO1 和 GO2 发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而 250 mmol·L-1 NaCl 培养基上 GO1 和 GO2 萌发率分别为 78.8%和 90.0%，野生型仅为 10.3%，分别提高了 68.5%和 79.7%。类似 地，300 mmol·L-1 甘露醇条件下，野生型的萌发率为 39.7%，转基因株系 GO1 和 GO2 分别提高了 42.9%和 50.8%； 正常萌发的种子移栽到 250 mmol·L-1 -1 NaCl 和 300 mmol·L 甘露醇条件 12 d 后，转基因株系根长、侧根数以及鲜 重等生理指标显著高于野生型对照；温室中正常生长 30 d 的苗期烟草在 250 mmol·L-1 NaCl 处理下，转基因烟 草 SOD、CAT 活性比野生型对照分别提高了 48.80%和 88.55%，而 MDA 含量比野生型对照降低了 61.61%，胁迫响 应基因 NtABF2、NtLEA5、Ntzfp、NtCDPK2 在 GO1 和 GO2 转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐 处理结果类似，300 mmol·L-1 甘露醇的处理下，转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】 烟草中异源表达耐辐射异常球菌 irrE 可以显著提高耐盐耐旱性；其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作 为植物耐逆基因工程的优良基因源。 关键词：密码子优化；irrE；转基因烟草；耐旱耐盐 Salt and Drought Tolerance in Heterologous-Expression of irrE Transgenic Tobacco ZHAO LeiLin, FAN Xin, NIE Xing, LIANG ChengZhen, ZHANG Rui, SUN GuoQing, MENG ZhiGang, LIN Min, WANG Yuan, GUO SanDui (Biotechnology Research Institu