基因工程与基因体外表达培训资料.pptVIP

置换型载体—可携带9-23KB外源基因 这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。图 3-12 是其结构示意图。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。 ????野生型 λ 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。如果 λ 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此，通过λ噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。 Spi 筛选 粘性质粒 是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNA c o s区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid的构造特点:(1)含有抗药标志和自主复制起始部位。(2)一个或多个单一酶的限制位点。(3)带有入噬菌体粘性末端。这一末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像入噬菌体一样进行体外包装。(4)分子小，约4—6kb，可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。 考斯质粒的优点　　1) 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞　　2) 可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA。　　 3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 M13 噬菌体 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成。 M13 噬菌体感染细菌后，其基因组经过复制转变成双链，称为复制型，复制型M13在细胞内拷贝数积累到100-200后，DNA合成变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量单链DNA，并被包装成成熟的噬菌体颗粒，从细胞中排出。 　　最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链。 用途：　　（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序　　（2）用于单链DNA的定点诱变　　（3）用于合成探针 M13噬菌体作为载体的优点及用途 整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。 病毒载体 表达载体 指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。 原核表达载体 在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表达元件。 （一）、启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。 开始转录 T T G A C A A A C T G T -35 区 (Pribnow box) T A T A A T A T A T T A -10 区 1 -30 -50 10 -10 -40 -20 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? 原核生物保守序列 RNA-pol辨认位点 (recognition site) 5? 5? RNA聚合酶保护区 结构基因 3? 3? 全酶 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有 Lac(乳糖启动子)、 Trp(色氨酸启动子)、 Tac(乳糖和色氨酸的双启动子) 、 λ PL(λ 噬菌体的左向启动子)、 T7噬菌体启动子等。 1、乳糖启动子结构示意图 CAP CAMP I P