基因工程－3章 基因工程载体.pptVIP

* * 3.λ-DNA作为载体的优点 λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取较为简便 λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因 * * 四、酵母人工染色体载体 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 * * 这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。 * * (一)酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC) YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为250 - 400 kb * * * * * * (二)细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosomes BAC) 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在100 - 300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,BACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 * * 3. 穿梭载体 穿梭载体(shuttle vector)：是指能在两种不同的宿主细胞中复制的载体,含有不止一个ori，能携带插入序列在不同种类宿主中繁殖，在原核细胞和真核细胞中都能复制和表达。 具有细胞质粒的复制起点和选择标记基因，同时具有真核生物的自主复制序列(ARS)和选择标记基因，具有多克隆位点。 * * 本章重点掌握的内容 概念:基因载体、报告基因、基因载体的致死效应、克隆载体、穿梭载体、质粒、质粒的拷贝数、质粒的不相容性、α-互补、插入失活、人工染色体载体。 基因载体具备的特性及克服基因载体致死效应的对策。 碱变性抽提法提取质粒DNA的原理。 pUC18/19质粒载体的组成、优点。 YAC载体组成。 质粒克隆载体用途。 λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 * * ①溶菌酶: 糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学键——肽聚糖β-1,4糖苷键。∴具有溶菌作用。 葡萄糖: 增加溶液粘度，维持渗透压，防止机械剪切力对DNA的降解。 EDTA(乙二胺四乙酸): 螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶活性(抑制DNA降解), 有利于溶菌作用和DNA完整释放。 * * ②NaOH-SDS液: NaOH浓度为0.2 mol/L，加入抽提液时，该系统的pH高达12.6，引起染色体DNA和质粒DNA变性。 SDS(十二烷基磺酸钠)——离子型表面活性剂，可溶解细胞膜脂质与蛋白，破坏细胞膜； 解聚核蛋白，能与蛋白质结合成R-O-S03-…R+一蛋白质复合物,使蛋白质变性沉淀下来。 * * ③KAc: pH4.8 KAc溶液可将pHl2.6的抽提液调节至中性→使变性质粒DNA复性，并稳定存在于溶液中。 3mol/L高盐KAc→染色体DNA变性、RNA、SDS-蛋白复合物凝聚沉淀。 因为染色体DNA核酸上电荷被中和，减少斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用，形成钾盐复合物，使沉淀更完全。 * * ④无水乙醇: 沉淀DNA 优点：具有很强的吸水性，可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不起任何反应，对DNA很安全。 DNA溶液(DNA以水合状态稳定存在)，当加入乙醇时，乙醇将夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而聚合。 * * ⑤苯酚-氯仿溶液:苯酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白质水溶液与苯酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被苯酚或氯仿挤出，使蛋白质失水而变性。 密度：苯酚-氯仿＞变性蛋白质＞水相 离心：从上到下： 上层：水相； 中间：变性蛋白质； 下层：苯酚-氯仿 使变性蛋白