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组织化学相关技术教程3.ppt
第四章 普通组织化学
?
普通组织化学是指以常用的组织化学技术,对细胞内主要化学成分和活性的粗略(一般性)的研究。
本章就几个经典实验概要介绍如下: ;一、?????? 核酸(DNA和RNA)
(一)?? 化学特性
1.分布: DNA (细胞核内)
RNA(核仁10% ;细胞质-核糖体90%)
2. 分子结构:戊糖 + 磷酸 + 碱基
特点:① 大量的磷酸基团→酸性
(嗜碱性的基础)
② 戊糖—被盐酸水解→醛基
(成为Feulgen法显示核酸的基础) ; ② 戊糖—被盐酸水解→醛基 (成为Feulgen法显示核酸的基础)
③ 可以完全水解或部分水解
④ 可以用RNAase或DNAase消化
[ 对照实验(—)];?
(一)?? 显示方法
1. 福尔根(Feulgen)反应显示DNA
[ 原理 ] 在60℃温度下,将DNA用1N盐酸水解,DNA双链打开成单链,先释出碱基,然后脱氧核糖释出醛基,该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。
;;;[ Schiff试剂显色原理 ]
碱性品红 亚硫酸 → 白亚黄酸
(无色试剂,称为Schiff试剂)
[方法]
固定剂的选择可用一般的组织学固定液,常
用Carnoy固定液。
Carnoy固定液:
纯酒: 氯仿: 冰醋酸 = 6:3:1
(60ml) (30ml) (10ml)
;恒冷箱切片机的具体染色步骤如下:
⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇(1:3 V/V)
中10分钟。
⑵ 由乙醇降至蒸馏水中。
⑶ 用1N盐酸浸泡。
⑷ 放入预热到60℃的1N盐酸中,留6分钟。
⑸ 放入室温的1N盐酸中。
⑹ 放入Schiff液试剂,保持在暗处,60分钟
⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次(脱掉未反应
的Schiff液)。 ;⑷ 保证Schiff试剂的纯净度。
⑸ SO2要新配制,除去多余的 Schiff液宜用之。
⑹ 必须对照。
2.? 显示核酸的其它方法
⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法
⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和
RNA法
⑶ 菊花青铬明矾(GC)显示核酸法
⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法
⑸ 核酸提取法;?一、?????? 蛋白质(Protein)
?
(一)蛋白质的分子结构
蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基??结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:—羟基、硫氢基、二硫基等。依其结构特点可分为:酸性氨基酸 和碱性氨基酸 ;芳香族氨基酸:苯丙氨基酸、酪氨基酸;杂环类氨基酸:组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。;?
(二)目前应用
1.? 用于蛋白质的一般定性
① 确定是否为蛋白质
② 确定蛋白质的酸碱性
③ 显示蛋白质的特殊基团
2.? 用于蛋白质功能定性和定位
;?(三)染色方法
目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶
组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以
显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。
1.四氮化联邻茴香胺法
(Tetra-azotized-o-anisidine)
[ 应用 ] 广泛应用于显示酶的活性
[ 原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下(<
5℃)可生成重氮盐,此即重氮反应。重氮盐可
与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物。上
述反应必须在酸性条件下进行。; 本实验,联邻茴香胺在酸性、低温条件
下与亚硝酸作用生成四氮盐。四氮盐有两个
重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所
要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结
合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈
类发生偶联反应以增色。因此,可以用生成
的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。 ;;; [ 方法 ]
1.? 四氮盐配制
⑴ 天平称取联邻茴香胺0.25g(有毒,通
风橱内进行)。
⑵ 在冰浴下,加入已预冷8%盐酸10ml,
玻璃搅拌,促其溶解,混合后为悬浊液。
⑶ 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中
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