组织培养基本相关技术.ppt

二、细胞传代方法 悬浮细胞传代步骤： 直接传代：细胞沉淀、吸掉多半上清液、吹打、传代。 离心传代：（常用此法） 细胞及培养液吸到离心管内； 800～1000r/min离心5min，弃上清液； 加新的培养基，吸管吹打，然后传代接种。 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 三、细胞系的维持 细胞系的维持： 就是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存来实现。 注意： 做好细胞系的档案记录工作； 遵从细胞生长的规律； 多种细胞系维持传代，要严格操作程序，防止细胞间交叉污染； 及时冻存。 四、培养细胞的纯化 细胞的纯化方法：自然纯化和人工纯化。 自然纯化： 利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化。 不能人为选择细胞。 三、培养细胞的纯化 细胞的纯化方法： 人工纯化： 利用人为手段造成对某一种细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，从而达到细胞纯化。 方法有酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法。 第四节细胞冻存、复苏和运输技术 一、细胞的冻存 冻存的意义： 节省人力和物力、维持原代细胞的特性。 在制备单克隆抗体时，为保证杂交瘤细胞不致因传代污染或因变异而丢失，应及时冻存。 购买的细胞株，经过1～2次稳定传代，及时冻存。 冻存的原理： 低温冷冻（-196℃） 为最大限度的保存细胞活力，细胞冻存及复苏基本原则是慢冻快融。 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果冷冻速度过快，形成的结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。而缓慢冷冻可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 使用浓度范围在5～15%之间。 细胞冻存步骤： 取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液 离心洗涤 加含有10%DMSO冻存液 混匀，移到冻存管（或安瓿） 封口，做好标记，4℃40～60min，-20℃20～40min， -70℃过夜 第二天放在液氮管，记录。 二、细胞的复苏 细胞复苏应采用快速融化： 快速融化使细胞顺利通过最易受损的-5～0℃，保证细胞外结晶在短时间内融化，避免缓慢融化时水分渗入细胞内再结晶，对细胞造成损害。 复苏失败的原因： 冻存细胞数量少或生长状态差 细胞污染 液氮不足 复苏时，培养条件改变 复苏方法不当 二、细胞的复苏 细胞复苏步骤： 从液氮罐取出细胞，迅速放到37℃水浴中。 融化后，取出冻存管，消毒开盖 液体移到离心管，添加培养液，1000r/min离心5min 除去上清液，用培养液稀释，计数、接种。 三、细胞的运输 细胞运输的方法： 冷冻储存运输： 液氮冻存运输： 充液法： 长距离运输（几天）：选择生长好的细胞，充满液体，封口，棉花包裹，到达目的地，吸去多余液体。 短距离运输（几小时）： 细胞悬液空运： 第五节培养细胞的观察和检测技术 一、培养细胞的常规观察 1、培养液： 直接用肉眼观察培养液的颜色和透明度的变化。 清亮透明，如出现混浊多为污染（悬浮细胞培养除外）。 颜色变化：桃红色，变黄表明代谢物增多，需要换液或传代处理。 培养液很快变黄：可能原因有细菌污染、培养器皿没洗干净，有残留物、细胞接种密度较大。 2、细胞生长情况： 倒置显微镜观察，细胞均需要经过一段适应期或潜伏期（时间长短不同）才增殖。 原代培养最先见从组织边缘“长出”细胞 传代的细胞潜伏期短，开始生长后很快进入指数生长期，长满瓶底的80%，及时传代。 3、细胞形态变化： 镜下观察到细胞透明度大、折光性强、轮廓不清，表明细胞生长状态良好。 用相差显微镜观察细胞的细微结构。 观察到细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中出现空泡、脂滴、颗粒样物质细胞间隙增大，变得不规则，表明细胞生长状态不良。 如果观察到细胞从瓶壁脱落、崩解、漂浮，表明细胞生长状态很差，要查明原因，采取措施。 4、微生物污染： 微生物污染包括细菌、霉菌、酵母菌、支原体等。 细菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表现为培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌。 传代稳定、生长规律的细胞系，如果培养条件不变而细胞生长明显缓慢、胞质内颗粒增多，但培养基多不发生浑浊，考虑支原体污染。 污染多发生在传代、换液和加药等操作之后。在这些操作之后的2