黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验.docVIP

2014级生物工程专业实验(II) 黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶 一、实验目的 掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。 二、实验材料 2.1菌株 黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。 2.2 实验试剂 糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。 2.3 实验设备 DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius 分析天平。 三、角蛋白酶液态发酵实验 3.1 工艺流程 3.2培养基及培养条件 3.2.1种子培养基及培养条件 （1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH 7.0，121oC 灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34oC，180 r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。 (2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34oC，静置培养72 h，取出麸皮种子40 oC烘干备用。 3.2.2发酵培养基及培养方法 发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH 7.0。培养基121oC灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34oC，500 r/min的条件下发酵72 h。 3.3 检测方法 3.3.1菌体浓度的测定 干重法。 3.3.2还原糖的测定 采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。 (1) 标准曲线的制：取9支洁净的25 m比色管编号，按表1加入试剂向9支比色管中加入mL DNS，摇匀，沸水浴中加热5 min，取出置于水中冷却，4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。浓度为横坐标，为纵坐标，绘制标曲线。(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测 定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线管号 葡萄糖溶液/m蒸馏水/m最终浓度/(mg/m1 0 0.5 0 2 0.05 0.45 0.1 3 0.1 0.4 0.2 4 0.15 0.35 0.3 5 0.2 0.3 0.4 6 0.25 0.25 0.5 7 0.3 0.2 0.6 8 0.35 0.15 0.7 9 0.4 0.1 0.8 3.3.3酸性蛋白酶活力的测定 Folin-酚法。 16周 实验日程安排 6.11日 （周日） 种子培养基的准备 固体麸皮种子：实验室研究生事先准备 液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。 6.12日 （周一） （1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制 （2）发酵罐操作、电极校正现场培训(第一组15:30；第二组16:30) 3、6.13 日（周二） （1）9:00 发酵罐接种培养(两组同时进行) （2）安排同学值班，每8 h取样一次 （3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳 3、6.14日（周三） （1）取样分析检测各项指标 （2）安排同学值班 4、6.15日（周四） （1）取样分析检测各项指标 （2）安排同学值班、测酶活试剂准备 5、6.16日（周五） （1）9:00 上罐结束，完成清洁卫生 （2）完成发酵各项参数的测定 需要准备的材料： 种子培养基：液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g(干重) 发酵培养基：3.5 L 发酵罐灭菌、电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、酒精、相关药品试剂等。酸性蛋白酶发酵实验值班表(第一组) 组 长： 联系电话： 小组成员： 日期 值班人 签字 设备运行情况 取样时间 取样人签字 6月日 9:00 接种 全体组员 (0 h) 9:00 9:00-21:00 8 h) 17:00 21:00-8:00 (夜班) (16 h) 1:00 6月日 8:00-21:00 (24 h) 9:00 (32 h) 17:00 21:00-8:00 (夜班) (40 h) 1:00 6月日 8:00-