华中农业大学动物病毒室猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗研究.pptVIP

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称兰耳病 1987年首次暴发于美国北卡罗纳州——“神秘病”，导致至少100万头猪死亡 1991年，PRRS席卷欧洲大陆 1996年，PRRS在我国首次爆发；同年，丹麦再次暴发PRRS，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡 2000年，美国再次大爆发PRRS，并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病 目前，PRRS遍及世界养猪国，并呈流行态势 能保护猪不出现临床症状，但不能阻止强毒感染。 只适合3-18周龄的猪和非孕母猪使用。 存在散毒问题和返强性，并且返强的几率相当高（可达30%)。 丹麦事件的教训：丹麦1996年7月使用美洲型PRRS弱毒疫苗免疫后，1996年底至1997年初出现了PRRS的多次大暴发，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡。病毒分离与全基因组序列分析证实是由疫苗株引起的(Masden et al,1998;Botner et al,2000) 与疫苗株同源性高达98%以上的强毒株越来越多 目前，许多国家已禁止使用弱毒苗。 较弱毒苗安全，但产生的保护力不强，需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。 疫苗安全性与有效性的矛盾以及目前尚无更好的疫苗使PRRS的免疫预防处于一种两难境况。 迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗 蓝耳病病毒结构 亚单位疫苗 DNA疫苗 腺病毒载体疫苗 伪狂犬病毒载体疫苗 GP5基因的修饰 在GP5基因N端的覆盖表位与中和表位间插入辅助序列 ，使中和表位充分展示 5’---FAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELN---3’ 表达修饰的ORF5m基因的DNA疫苗 ELISA抗体（小鼠） 中和抗体（小鼠） 细胞免疫（小鼠） ORF5与ORF6基因共表达DNA疫苗 ORF5/ORF6双基因共表达对GP5和M蛋白的亚细胞定位的影响 ORF5/ORF6双基因共表达显著增强中和抗体 ORF5/ORF6双基因共表达显著增强细胞免疫 研究表明： 1. 体外表达的GP5蛋白可以与M蛋白通过二硫健形成异源二聚体，并且这种二聚体的形成有利于GP5蛋白从内质网向高尔基体的转运，有利于免疫提呈的增强，提高免疫应答。 2. GP5-M异源二聚体形成的几率和多少与免疫反应的强弱具有正相关性。 ORF5m与ORF6基因共表达DNA疫苗 PRRSV新一代疫苗设计 具有更好免疫原性的ORF5m基因为候选基因； 采取GP5m和M蛋白共表达策略； 以PRV基因缺失标志疫苗株表达系统，构建PRV-PRRSV二价基因工程疫苗。 RV5: TK-/gE-/GP5+ RV56: TK-/gE-/GP5+/M+ RV5m：TK-/gE-/GP5m+ RV5m6:TK-/gE-/GP5m+/M+ 重组病毒免疫小鼠后的PRV中和抗体 重组病毒免疫小鼠对PRV的免疫保护 重组病毒免疫小鼠后的PRRSV中和抗体 重组疫苗产生的针对PRV的抗体 PRRSV中和抗体检测 针对PRRSV的细胞免疫反应 攻毒后体温变化 攻毒后的病毒血症和排毒 肺部组织病理变化 肺门淋巴结病理变化 研究表明： 以伪狂犬病毒为载体共表达修饰的GP5m和M蛋白的重组疫苗能够同时诱发较强的针对PRV和PRRSV的免疫应答，具有较好的免疫保护，有望成为新一代安全、高效的PRRSV新型疫苗。 临床初步应用： 免疫预防 对发病猪的紧急接种 进一步对ORF5基因进行修饰，目前已获得18个突变体，其中对ORF5进行糖基化修饰后的突变体ORF5/34-/51-较天然的GP5产生的中和抗体高100倍。 构建伪狂犬病-蓝耳病-圆环病毒-猪瘟的四价基因工程疫苗。 “自杀性”DNA疫苗 以甲病毒复制子为载体，自主复制，保障外源基因的高效表达； 诱导被转染细胞发生细胞凋亡，增强免疫提呈，避免常规DNA疫苗整合到宿主基因组、细胞转化等潜在的安全性隐患。 是一种更安全、更有效的新型核酸疫苗。 PRRSV“自杀性” DNA疫苗 pSFV-5m6/RV5m6免疫猪后PRRSV中和抗体 PBMC的淋巴细胞增殖 攻毒后体温变化 病毒血症和排毒 构建的rPRV-PRRSV重组病毒： 0/0/0 0/0/0 0/0/0 0/0/0 6/6/6 6/8/10 Control NA/NA/17.3 0/0/1 0/1/4 0/4/1 6/1/0 6/8/10 TK-/gE-/GP5m+/M+ NA/NA/10.7 0/0/0 0/2/2 1/3/4 5/1/0 6/8/10 TK-/gE-/GP5m+ NA/NA/NA 0/0/0 0/0/0 0/4/5 6/2/1 6/8/10 TK-/gE-/GP5+/M+ NA 0/0/0 0/0/0 0/0/1 6/6/5 6/8/