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第二章 植物基因克隆的工具酶 据统计： 1986年：615种限制酶，98种甲基化酶 1998年：1000种细菌或古细菌中存在3000多种酶，且200多种特异性。 2006年：4583种酶，其中限制酶3773种， 例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 限制性内切酶以双链DNA为底物，识别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷酸二酯链，产生具有3’-OH和5’-P的DNA片段。 限制性内切酶作用过程 （六）限制性内切酶的识别与切割 1.在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子产生链的断裂 2.识别由4-8个（多数4-6个）核苷酸组成的特定的核苷酸序列 3.识别碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），切点就在其内部。 回文结构（Palindromic） 限制性内切酶切断DNA链上磷酸二酯键的位置一般在识别序列内部， 如G↓GATCC，AT↓CGAT； 也有少数在识别序列的两端 如↓GATC，CATG↓。 不同核酸内切酶的特异识别位点 核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用 ? 酶反应的终止 终止酶反应的方法有： ①65℃保温10min。（只对此温度敏感的酶 ，如EcoRI） ② 用饱和酚、氯仿抽提DNA方法纯化。 ③加入终止反应液，多为电脉上样液，主要成份为50％甘油，100mM EDTA(pH=8.0), 1％SDS和0.1％溴酚兰（不同厂家生产的有一定区别）等。 ? 酶反应的终止 若消化后的 DNA 不需要进行后续的实验操作， 用终止液终止反应。 有些厂家在内切酶包装中，会同时附上10?loading buffer（1%SDS；50%甘油；0.05%溴酚蓝），使用添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。 若消化后的 DNA 需要进行后续的实验操作，用热失活法或酚/氯仿抽提去除内切酶。 目前国际主流的限制性内切酶厂家 New England Labs（美国） Takara（日本） Fermentas（立陶宛） Sibenzyme（俄罗斯） Promega（美国） 酶切位点的分析软件 DNASTAR Primer 5.0 Primer 5.0软件分析酶切位点 DNASTAR 软件分析酶切位点 部分常用的限制性内切酶 有一些限制酶的识别顺序不是对称结构 ５’－CCGCTC－３’ ３’－GGCGAG－５’ AccBSI BssSI ５’－CTCGTG－３’ ３’－GAGCAC－５’ 同裂酶（isoschizomers） 概念 用途 有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 有一些来源不同的限制性酶识别的是相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 识别位点的序列相同 同裂酶（Isoschizomers) ① 完全同裂酶（同序同切酶） 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ Hsu I 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’ 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 ② 不完全同裂酶（同序异切酶）： 用途 如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶，共同的靶序列是CCGG。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），HpaⅡ不能够切割它，而MspⅠ对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C残基甲基化与否都能够切割。 * 现已研究发现，许多动物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG处以5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较Hpa