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蚊虫研磨液阳性分离物病毒液cDNA制备 目的： 对出现CPE的病毒液提取病毒RNA，反转录制备cDNA，进一步做PCR鉴定。 二、材料 蚊虫研磨液阳性培养物病毒液 病毒RNA提取试剂盒（QIAGEN） 反转录试剂盒 无水乙醇，随机引物等 主要仪器：冷冻高速离心机，小离心机，-20℃冰箱，水浴箱（65℃，37℃） 二．实验步骤 1.Carrier RNA的稀释 Carrier RNA用Buffer AVE来稀释。将310μL AVE加入含310μg冻干的Carrier RNA管中，使Carrier RNA的终浓度为1μg/μL,每个样品需要0.56mL AVL,需要5.6μL Carrier RNA- AVE。 避免Carrier RNA的反复冻融。 2.按说明配制AW1和AW2（加入无水乙醇）。 3.病毒RNA提取 1）将感染细胞培养液在12000rpm和4℃条件下离心5min，取上清140μL到一个无RNase的1.5mL EP管中（需要在P2实验室及生物安全柜中完成），同时设置阴性及阳性对照 2）用无RNase的1000μL吸头取560μL加有Carrier RNA的AVL溶液到上述140μL样品中，轻轻振荡，混匀15s，室温静置10min 3）短暂离心EP管，去除管壁上的残留液 4）向处理样品中加入560μL无水乙醇，轻轻振荡混匀15s，短暂离心EP管 5）小心吸取630μL上述步骤中的样品到一个2mL柱式离心收集管的吸附柱中，盖紧管盖，8000rpm离心1min，弃掉收集管，将吸附柱放入一个新的收集管中 6）小心打开管盖，重复步骤5 7）小心打开管盖，加入500μL的Buffer AW1，盖紧管盖，在8000rpm条件下离心1min，弃掉收集管，将吸附柱放在新的收集管 8）小心打开管盖，加入500μL的Buffer AW2，盖紧管盖，在1300rpm条件下离心3min 9）小心取出吸附柱，将吸附柱放入一个新的无RNase的1.5mL EP管中，向吸附柱中央加入40~60的Buffer AVE洗脱液，室温放置2min 10）将EP管在8000rpm条件下离心1min，去掉吸附柱，RNA可短期保存于-20℃条件下，也可直接进行RT-PCR。 4. 逆转录生成cDNA 使用逆转录试剂盒完成 1) 使用前先检查，确认每管中有两颗白色颗粒，且均位于管底部 2) 将RNA样品于65℃水浴10min,然后立即置于冰浴中2min 3) 取出32的μL样品加入管中（白色颗粒自然溶解），室温静置1min 4) 加入随机引物pd（N）6 1μL，根据加入的RNA量适量补充DEPC水，使最终体积为33μL，室温静置约1min。 5) 轻微振荡混匀，短暂离心使液体均聚集于管底。 6) 反应管置于37℃，恒温条件反应60min 7) 合成好的cDNA可直接进行PCR或-20℃冻存