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综合实验操作—动物细胞培养 课程论文 生物技术1101班 第四组 题目：小鼠细胞培养实验操作 组长：谢林青 组员：宋嵘锡 任义芳 盛霞 王俊杰 王星 指导教师：张玉喜 完成时间：2014年6月7日 一、实验目的 1、初步掌握哺乳动物细胞原代、传代培养操作过程 2、了解细胞原代、传代培养的技术 实验原理 理论上讲，各种动物和人体的所有组织都可用于培养，但幼体组织比成年个体组织更容易培养，分化程度低的组织比分化程度高的组织容易培养。细胞培养是一项程序复杂、要求条件多且严格的实验性工作，用于培养的组织在取材后应立即处理，尽快培养。细胞在体外长期生长需要提供细胞必需的生存条件，实验中消毒、配液等操作均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。 三、实验用品 1材料：小鼠 2器材：吸管，剪刀，镊子，滤菌器，培养瓶，培养皿，烧杯，离心管，水浴锅，超净工作台，移液器，枪头，高压灭菌锅。 3试剂：75%酒精，Hank’s洗液，0.25%胰液，DMEM培养液，小牛血清，PBS培养液 大体实验流程 1.试剂配制 （1）小牛血清：放入56℃水浴30min，其间不时轻晃，使其受热均匀，防止沉淀析出。 （2）Hank’s洗液（g/L）：平衡盐溶液 依次加入NaCl 0.01, KCl 0.4, CaCl2 0.14, NaHCO3 0.35, KH2PO4 0.06, Glucose 0.34.混匀配制。 （3）DMEM培养液：将干粉培养基溶于总量1/3三蒸水，用1/3三蒸水冲洗包装2次，搅拌使其溶匀，加抗生素终浓度青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，调PH7.2~7.4定容，过滤除菌，分装于玻璃瓶中，4℃冰箱保存备用，用前加小牛血清（培养液10%体积）。 2.实验操作 （1）分别将4把剪刀，3把镊子，大、小培养皿，离心管，一盒枪头，滴管若干，20个培养瓶，3个小烧杯进行包装后捆扎放入高压灭菌锅中进行灭菌。 （2）将配制的Hank’s洗液，培养液，胰液在超净工作台用滤菌器分装进灭菌好的培养瓶中，放入冰箱以备用。 （3）研磨法：将小鼠引颈处死75%酒精浸泡2~3s（防止从口中和肛门浸入体内），在超净工作台上解剖，取肝脏，肾脏，脾置于培养皿中，用Hank’s洗液（或者PBS洗液）洗涤3次（剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物），将肝脏、肾脏、脾通过钢丝网研磨到小烧杯内，用Hank’s液洗涤3次，离心弃上清，放入培养瓶中，加入培养液，37℃培养。 胰液消化法：将小鼠引颈处死75%酒精浸泡2~3s（防止从口中和肛门浸入体内），在超净工作台上解剖，取肝脏，肾脏，脾置于培养皿中，用Hank’s洗液（或者PBS洗液）洗涤3次（剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物），加入组织块5~10倍的胰酶液，37℃水浴消化20~40min，每5min震荡一次，使细胞分离，颜色略发白时加培养液和小牛血清，离心，弃上清加洗液再次离心弃上清加培养液，37℃培养。 传代培养。 五、具体实验 （一）器械的清洗与消毒及培养基的配置 1.清洗 【实验原理】 在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。 【实验目的】 学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。 【仪器、材料及试剂】 仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器。 材料：0.22μm微孔滤膜。 3．试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。 【操作步骤】 （1）玻璃器皿的清洗 步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。 ①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。 ②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。 ③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，