药品的细菌(霉菌及酵母菌)计数检查技术.ppt

第六节 药品的细菌（霉菌及酵母菌）计数检查技术 授课人:汪穗福(高级讲师) 苏惠虹(助理讲师) 广州市医药中专学校 2005年3月 药品中细菌（霉菌及酵母菌）的计数检查是检测药物在单位重量或体积(克或毫升)内所含有的活菌数量，用以判断药品被污染的程度和标志，其内含是多义的。细菌数越多，表明药品受到致病菌污染的机会和可能性也较大，安全性也就越差；同时细菌数计数测定也包括药物的各种原料、工具设备、操作人员及工艺流程等各个环节的卫生状况和GMP评价的一个综合依据之一。由于中西药制剂中的各种剂型是非密封药品，不可能绝对无菌，药典规定允许一定数量的微生物存在。其主要标准见第三节内容，但均不能检出控制菌。 药品中细菌（霉菌及酵母菌）的计数检查《中国药典》（2005年版）规定为平皿法与薄膜过滤法两种方法。平皿法又称之为平板菌落计数法，该法是一种活菌计数法。 测定结果只反映出在规定条件下生长的菌数，不可能包括在本条件下不生长或繁殖能力差的菌。因而测定数目可能低于实际的污染数。此外，测定中一个细菌可能繁殖成一个菌落。而一群也可能只形成一个菌落，以及污染的不均匀性等等原因，极易造成测定差异，故在测定时，必须严格按微生物限度检查所规定条件操作。 同时在正式检查操作前要进行验证试验，以证实方法和操作的可靠性和可行性，具体详见第十二节内容。 一、平皿法计数测定 （一）细菌、霉菌或酵母菌计数的测定 本法采用的是营养琼脂倾注平皿计数法。即取规定量的被 检药品，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀 (需事先灭菌)稀 释成不同比例的供试品稀释液(10-1 ；10-2 ；10-3 ；……)， 然后应分别吸取适宜的连续2~3个稀释度的供试品稀释液 1ml置每一灭菌平皿中（不同稀释度至少制备2个）， 再于每一平皿中分别倾注15－20ml温度不超过45℃的细菌、霉 菌或酵母菌琼脂培养基（细菌用营养琼脂、霉菌用玫瑰红 钠培养基、酵母菌用酵母浸出粉胨葡萄糖），均匀混和后， 于30～35℃培养48h后根据菌数报告规则计数，然后再将平 均菌落数乘以稀释倍数，即可得每g或每ml被检药物中的细 菌、细菌、霉菌或酵母菌总数。如超过一定的限量即可认 为不合格。其测定过程如图7－1所示。 菌数测定阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。（二）菌数计数与菌数报告规则1．计数 除另有规定外，细菌培养48 h，分别在24及48 h点计菌落数，一般以48 h的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72 h，分别在48及72 h点计菌落数，一般以72 h的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7d进行菌落计数。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。 2．菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 ⑴ 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数。 ⑵ 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告菌数。 ⑶ 当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 ⑷ 当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数 报告菌数。 ⑸ 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。 （三）菌落计数（微生物限度）检查注意事项 在进行药品菌落计数（微