2014蛋白质-80.ppt

二、高级结构与功能的关系 2、蛋白质的变性与复性 天然蛋白质受各种不同理化因素的影响，氢键、疏水键等次级键维系的高级结构被破坏（空间构象），导致生物学、理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。 改变氨基酸残基侧链的离子化状态，从而影响蛋白质的电荷外布和氢键的稳定性。 （十二烷基硫酸钠） 能与蛋白质非极性侧链相互作用而破坏天然蛋白质的疏水相互作用。 尿素和胍离子 能与蛋白质内氢键基团形成更强的氢键 高度水溶性，增大了非极性侧链在水中的溶解度 破坏蛋白质分子内原有的疏水相互作用。 变性因素 变性原因 pH的变化 去垢剂 离液试剂 增大非极性物质在水中的溶解度，破坏蛋白质分子内部的疏水相互作用的能力 蛋白质的复性 p98 －S－S－不是正确折叠所必须的。 在蛋白质合成后的加工中，二硫键的形成可以使它们保持有活性的天然状态。 第十节 蛋白质的性质 一、蛋白质的两性解离和pI R基的解离 二、蛋白质分子的大小 等离子点 纯水中蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。 1.根据化学组成测定最低相对分子量； 测定蛋白质中某一特殊元素的含量计算最低分子量。设蛋白分子中含一个被测元素。 2.超离心 沉降系数——单位S（10-13） 凝胶过滤，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是亲水胶体。 蛋白质分子直径2～20nm，胶体溶液质点大小1～100nm，布朗运动，丁达尔现象，不透过半透膜等特性。 透析 透析去盐类等小分子物质 四、蛋白质的沉淀作用 水化层：亲水基团与水分子结合形成的水膜，它使Pr颗粒不易聚集。 带电层：在一定的pH环境下，带相同的电荷，使Pr颗粒相斥。 任何破坏水化层和带电层的因素都能使Pr分子聚集而沉淀。 P102图 五、蛋白质的变性作用 六、蛋白质的颜色反应 P104 表3-13 双缩脲反应是一切蛋白质及肽均具有的反应！ 第四节? 蛋白质的分离与鉴定 纯 度 蛋白质分离纯化步骤 提取 分离纯化 鉴定 组织匀浆、细胞破碎、盐析、离心、超滤 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析 高效液相色谱－质谱 双向电泳－质谱 注意：保持生物活性 分子大小 溶解度 电荷 特异生物学亲和力 高效液相层析 ——透析、超过滤、凝胶过滤 ——盐溶、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀 ——离子交换层析、凝胶电泳 ——亲和层析 常用蛋白质的分离纯化方法 一、蛋白质的溶解性质与盐析分离 1、胶体性质 双电层 水化层和双电层是蛋白溶液稳定的两个因素 水化层 水化层 等电点条件时蛋白质净电荷接近零，溶解度最小！ 2、盐溶现象与盐析现象 很低盐浓度 —— —— —— ——盐浓度升高 盐溶：在盐浓度很稀低范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度升高的现象。 盐析：随着溶液中盐浓度升高，蛋白质的溶解度逐渐降低，蛋白质分子相互聚集发生沉淀的现象。 ？ 3、盐溶与盐析原理 破坏电荷层，争夺水化层。 （NH4）SO4 溶解度大且随温度变化小，不易使蛋白质变性! 增强水化层，降低蛋白质分子间的静电吸引。 4、盐析——硫铵沉淀 硫酸铵粉末或饱和硫酸铵溶液 透析去盐类等小分子物质 二、离子交换柱层析 阳离子交换剂 阴离子交换剂 改变盐类离子强度和pH 等电点大于7的蛋白质 等电点小于7的蛋白质 初始pH5.0 初始pH8.0 三、疏水层析 蛋白质分子表面也存在一些疏水基团。 疏水层析：利用蛋白质分子的疏水侧链与层析基质上的非极性基团之间的相互作用来分离纯化蛋白质。 疏水层析：利用蛋白质分子的疏水侧链与层析基质上的非极性基团之间的相互作用来分离纯化蛋白质。 洗脱方式：梯度降低水性缓冲液离子强度（疏水作用减弱）。 洗脱液：通常为水性缓冲液。 四、凝胶过滤层析 分子排阻层析 分子筛层析 高度水化具不同大小孔径的网状结构的惰性多聚物颗粒。如：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶。 大分子 小分子 四、凝胶过滤层析——测定蛋白质的相对分子量 A280 五、亲和层析 亲合层析：根据蛋白质的配体专一性建立的分离方法。 配体：与某种蛋白质专一结合的分子。 六、蛋白质电泳 在pH9左右缓冲体系中，蛋白质组分具有净负电荷，在电场中向正极泳动，大小和净电荷相同的分子泳动速度相同，形成一个区带。 制胶板 电泳槽 电泳仪 聚丙烯酰胺凝胶 1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ——分离有生物活性蛋白质 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS：十二烷基硫酸钠，一种带负电荷的阴离子去污剂。 获相同荷质比的SDS-蛋白复合体 SDS破坏氢键和疏水作用，蛋白变性 巯基乙醇破坏二硫键 获得松散多肽链 SDS所带负电荷覆盖蛋白所带电荷 SDS-蛋白复合体均呈长椭圆棒