2015-流式培训.ppt

FACSVantage DIVA 1996.11 湖南医科大学引进第一台 FACS AriaIII 2003.12中科院上海健康中心引进第一台AriaI, 2008.6上海生化细胞所 AriaII BD Influx 声学耦合喷嘴 FACSCalibur 谢 谢 ！ * 自由基水平检测 线粒体膜电位（JC1） 细胞增殖 cfse EdU(5-乙炔基-2′-脱氧尿苷) BrdU(?5-溴-2′-脱氧尿苷) 细胞凋亡 PI Annexin-v GFP Sub G1 细胞周期 SP细胞分析 CBA检测细胞因子水平 流式多色分析的实验设计 6色荧光分析 多色流式—根据染料光谱与仪器配置合理组合 荧光染色组合的几个原则 仪器的激光/滤光片的组合 荧光染料的激发和发射谱 多荧光染色注意要减小荧光光谱重叠 荧光素亮度与目标分子密度的匹配 使用多杆激光，但需避免多重激发 小心使用组合染料（tandem dyes） 设定合适的对照样本（包括调节荧光补偿的样本） AriaIII仪器配置 488nm：FITC(530/30) PerCP(670/30) PerCP-Cy5.5(710/50) 561nm: PE(582/15) Pe-TxR(610/20) PE-Cy5(670/14) PE-Cy7(780/60) 635nm: APC(660/20) Alexa Fluor700(710/50) APC-Cy7(780/60) 375/405：DAPI(450/40) Pacific Orange(530/30) Qdot605(616/23) 4色 FITC-488 PE-561 APC-635 DAPI-405/375 8色 FITC PerCP-Cy5.5 PE PE-Cy7 APC APC-Cy7 DAPI Qdot605 488 561 635 405 PerCP PE-TxR PE-Cy5 Alexa Fluor700 Pacific Orange 不需要调补偿 APC与组合染料PE-Cy5不可同时使用 使用组合染料及时检测 0小时 2小时 22.5小时 CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 PE 样本制备和标记 单细胞悬液 荧光标记染色 样品上机检测/分选 数据分析 细胞浓度：检测 105 /ml 分选 106 /ml 室温或冰上避光30min 流式分选 P5、P6同时分选收集 P5分选后测纯度 P6分选后测纯度 细胞分选注意事项： 全部过程需无菌操作 尽可能维持细胞活性 接收管里提前加入适量培养基 分选后培养细胞的培养基加抗生素 如收集的细胞太少，应避免离心 接收样品可以选择15/1/0.5ml离心管，5ml流式管，6/24/48/96/384孔板 可以分选单细胞 FACSCalibur开关机程序 开机 关机 主机 电脑 检查鞘液罐和废液罐 压力阀 次氯酸钠清洗5分钟 水清洗5分钟 Standby待机5-10分钟 关电脑，关主机，关闭压力阀 流式细胞术原理及应用 贾俊英 生物物理所蛋白质科学研究平台 结构与功能实验室 2015-9-14 主 要 内 容 流式细胞仪的功能特点 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪的应用 流式多色分析的实验设计 流式细胞仪的概念 细胞或颗粒以单个排列的方式依次 经过检测区，收集细胞被激光照射后所激发的各种荧光信号，并对这些荧光信号进行处理后将多个荧光信号进行关联分析的一种仪器。 流式细胞仪介绍 荧光显微镜 流式细胞仪 视野内全部细胞静止 细胞单个依次高速流动 人眼/CCD成像等 光电倍增管 多激发 同时多激发 流式细胞仪测量对象：单细胞悬液 原子 0.1nm 1nm 10nm 100nm 1μm 10μm 100μm 1mm 氨基 酸 蛋白 质 病毒 支原体 细菌 红细胞 上皮细胞 植物细胞 电镜 光学 显微镜 人眼极限 流式细胞仪检测参数 核酸分析： DNA、RNA含量，DNA合成、降解、断裂，区分核酸单、双链，测量端粒长度、染色质结构 、碱基构成， 染色单体分选 细胞膜：表面糖分子、细胞膜流动性和通透性、膜融合和翻转、膜脂质构成、细胞膜及线粒体膜电位等 细胞质：（1）Ca2+、Na+、K+、H+ （2）信号网络蛋白、各种抗原、各类酶分子、细胞骨架蛋白、荧光蛋白（3）酶活、蛋白磷