水稻mapk基因的获得.docVIP

水稻中MAPK基因的获得 植物保护学院 植物病理 高琳 2011339 摘要：本研究利用设计好的MAPK基因的引物，以水稻的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增片段经电泳检测后用SacI、KpnI进行酶切，检测酶切完全后体外连接酶切产物，获得重组子，转化感受态细胞，挑克隆扩繁，提取质粒进行酶切，筛选鉴定。 关键词：PCR；电泳；酶切；连接；转化；筛选 1 材料与方法 1.1试验材料 水稻基因组DNA，MAPK基因引物。 1.2目的片段的获得 根据已经合成的MAPK引物以水稻全基因组DNA为模版进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性2分钟，然后循环：94℃ 30S，?60℃ 30S，72℃ 60S，共28轮循环。循环结束后，72℃ 8分钟。反应体系：模板DNA (5ng/μL) 1.0μL，引物P1P2 (10μmol/L) 各0.6μL， 10×PCR Buffer 3.0μL， dNTPs（2.5mmol/L）2.4μL， Taq酶（5U/μL）0.6μL ，加ddH2O至 30 μL。扩增的PCR产物4℃保存。取2μL对PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。 1.3目的片段的纯化回收 将PCR产物加入H2O补足体积至100μL，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀DNA。12000 rpm/min 4℃ 离心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加4 μLddH2O溶解。 1.4载体和目的片段的酶切 载体质粒酶切反应为：质粒2μL (20ng/μL)，bf 5μL， SacI 0.5μL (10U/μL)， KpnI 0.5μL (10U/μL)，H2O2 42μL。 目的片段反应体系为：PCR产物10μL (50ng/μL)（乙醇沉淀后的PCR产物），bf10μL，SacI 0.5μL (10U/μL)，KpnI 0.5μL (10U/μL)，H2O 79μL。反应条件为：37℃，2-4hr； 65℃，10min，终止反应。 取10μL质粒载体酶解液，电泳检测。PCR产物酶切后不必电泳检测，直接回收即可。 1.5 酶切片段的纯化及其回收 将酶解液加入H2O补足体积至100μL，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀DNA。12000 rpm/min 4℃ 离心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加4 μLddH2O溶解。 1.6 目的片段DNA与载体质粒的连接反应 试剂盒操作，依次添加以下试剂：无菌水3(L，PCR酶切产物4(L，10×bf 1(L，质粒酶切产物1(L，T4 ligase1(L。轻轻弹动离心管以混均内容物，短暂离心，14-16℃连接。连接好后存放在-20℃备用。 1.7质粒转化 取40 μL新鲜制备的感受态细胞，加入连接产物10μL（~50 ng ）混匀冰上放置30 min。同时作2个对照管：对照1：40 μL感受态细胞＋ 10μL无菌水（不含氨苄皿）对照2：40 μL 感受态细胞＋ 1μL 标准质粒DNA溶液（10ng/μL）。将管放到42℃循环水浴90-120sec。冰浴2 min。每管加600 μL LB液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。注意对照2离心后涂10-50μL。（提前倒好平板）倒置平皿37℃培养12-16 h，出现菌落。计算阳性对照的转化效率，记录样品的转化子总数。 1.8 重组克隆的筛选与鉴定 从获得的平板上，挑取单克隆，加入含有3mL LB+Amp100的试管中，37℃振荡培养过夜。取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。提取重组质粒。注：剩余培养物放置4℃，用于保菌。取2μL质粒进行双酶切，酶切体系如下：10×bf 2μL，限制酶各0.5μL，H2O2 15μL。37度，2-4hr。1%琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果与分析 2.1 PCR扩增产物 经过PCR得到与预预期目的片段大小相等的基因，大小约为1000bp，与预期的1059bp基本一致（如图1）。 5000bp 3000bp 2000bp 1000bp 750bp 图1PCR扩增目的片段 2.2 酶切质粒检测结果 经双酶切完全的质粒被切为一大一小的片段，大的约为4K,小的仅为几个bp。经过电泳检测，在琼脂糖电泳上只能看到大的片段，小的片段已经跑出胶体。在图中看到仅有一条大的片段说明酶切完全（如图2）。 5000bp 3000bp 2000bp 1000bp 750bp 图2酶切质粒 2.3 酶