交大近代仪器分析课件第四章Fluorometry.ppt

* * * * 第四章 荧 光 分 析 法 (Fluorometry) 一、分子发光的类型 分子发光 分子荧光(molecular fluorescence) 分子磷光(molecular phosphorescence) 化学发光(chemiluminescence) 生物发光(bioluminescence) 二、基本原理 1.荧光、磷光的产生及去活化过程 A、基态?2 B、激发单线态??* C、激发三线态??* 能量 ?* ? ? ? ?* ?* A B C 单线态和三线态的电子分布 荧光、磷光能级图 S0 S1 S2 T1 F P 振动驰豫 内转换 系间跨越 F P 辐 射 无辐射 振动驰豫 内转换 外转换 系间跨越 2. 激发光谱和发射光谱 荧光物质分子都具有两个特征光谱： 激发光谱(excitation spectrum) 发射光谱(fluorescence spectrum) 激发光谱：指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长的相对效率。F ~?ex 荧光光谱：表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度. F ~?fl b.激发光谱和荧光光谱的用途 定量分析：在作定量分析时，激发波长和荧光波长应选在最大发射强度所对应的激发波长和荧光波长处，分别称为最大激发波长和最大荧光波长。 定性分析：在一定条件下，每一种荧光物质都有两个特征的光谱——激发光谱和荧光光谱； c. 光谱特征 1）Stokes shift E=h/? E ? 最大荧光波长最大激发波长 2）荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称 荧光光谱 激发光谱 S0振动能级 S1*振动能级 300 400 500 nm F 硫酸奎宁的激发光（红）谱和荧光光谱（蓝） 3）. 荧光光谱的形状通常与激发波长无关 S0 S0 S1* S1* S2* S0 e.g. 3. 荧光产生的条件 a. 荧光效率（荧光量子产率?） = ? = 发射荧光的分子数 激发态的分子数 发射的光子数 吸收的光子数 b. 荧光与有机物结构的关系 ? ?* （? ? 104） 跃迁类型 n ?* （? ? 102） ?* ?能产生较强的荧光 在具有刚性平面结构的?电子共轭体系的分子中 ?电子共轭度 分子平面度 量子产率 荧光越易产生 e.g. 联二苯 = 0.2 ? c 芴 ? = 1.0 c.影响荧光强度的外部因素 温度升高，荧光效率和荧光强度将降低； 溶剂极性越大，荧光波长将会长移； 溶剂粘度越小，荧光强度越小； pH值的影响，荧光物质都有它最适宜的pH范围; 荧光熄灭剂的影响 散射光的干扰 4. 定量分析方法 a. 荧光强度与荧光物质的关系 IF = k1（I0-I） I I0 = 10-?bc IF = 2.3k1 I0 ?bc ?bc?0.05 I0一定 IF = kc 式中表明： （IF只与I0有关） I0 IF 紫外可见分光光度法 I0 I I0 不一定 灵敏度：荧光法紫外可见分光光度法 b. 定量方法 标准曲线法： c IF cx IFx 比例法： cs IFs – IFo = k cs IFx - IFo = k cx cx = IFx – IFo IFs - IFo ? 三、荧光分析仪器 光源 第一单色器 样品池 第二单色器 检测器 放大器和记录仪 I0 I F 四、荧光新技术 激光荧光分析（光源：激光）； 时间分辨荧光分析（荧光寿命的差异）； 同步荧光分析（选择波长差值，同时扫描两波谱） 胶束增敏荧光分析 * *