环境微生物实验第一组.docVIP

染料脱色实验 一、实验目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 1.3 掌握观察微生物群落形态的方法； 1.4 掌握菌种分离保存的技术与方法。 二、实验说明 本次实验从菌种的分离、筛选、到菌落观察、脱色测定及菌种保存共历时二十天，分为五个连续实验，最后将从土壤中分离出的脱色效果较为明显的菌种进行保存。 具体步骤如下所示： 实验一 脱色培养基的配制及脱色微生物的分离 一、目的要求 1、掌握培养基配制的一般步骤； 2、掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法； 3、熟练平板制备技术及涂布技术； 4、了解土样采集过程的注意事项； 5、了解脱色微生物分离的一般原理； 二、实验原理 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用培养基从土壤中分离的微生物 三、实验仪器 3.1培养基葡萄糖 1%, KH2PO4 0.1%, (NH4)2SO4 0.1%, MgSO4 0.05%, 酵母膏 0.02%，染 料 50 mg.l-1（母液浓度1000 mg.l-1），固体加琼脂3.0% 3.2仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接环，无菌培养皿，土样 四、实验步骤 4.1 土壤悬浮液的制备 2、约20min后，吸取100μL上清液进行涂布。 4.2 脱色培养基的制备 1、液体培养基的制备 根据配方称取所需要的材料，将称取的材料加入有刻度的搪瓷烧杯，用自来水补足到200mL，并记下刻度。在电炉上加热溶解，并用玻璃棒搅匀。趁热将配置好的液体培养基分装至20支带有塞子的无菌试管中。 2、固体培养基的制备 用上述方法先配置300mL液体培养基，然后加入称好的琼脂，加热至沸腾，期间不断用玻璃棒搅拌，以防糊底，直至琼脂完全熔化。最后补足蒸发损失的水分。将配置好的固体培养基分装至两个带棉塞的无菌锥形瓶中。 3、培养基的消毒与灭菌 ① 在灭菌锅里加入一定量的水，将用防水纸包扎好的培养基放入灭菌锅； ② 旋紧四周固定螺旋，接通电源，进行加热； ③ 当压力达到0.35kg/时，打开放气阀，使锅内空气和水蒸气一同排出，直至压力表读数恢复至零，然后关闭排气阀，继续加热； ④ 当压力表上的压力到达1.05 kg/，灭菌锅内的温度达到121，维持15~~30min。 ⑤ 灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零，打开排气孔，然后打开灭菌锅盖，取出培养基。 ⑥ 取出物品后，倾去锅内余水，以保持灭菌锅内壁和内胆的干燥。 4、涂布 将灭菌后的固体培养基倒入六个培养皿，冷却后即成平板培养基。用移液管移取0.1mL土壤上清液小心地滴在平板培养基表面中央位置。?右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。 5、培养 将涂布后的脱色培养基倒置放在37℃培养箱中培养3～5d 五、实验现象 培养三天后，平板培养基颜色退去，表面长出不同的菌落，每个培养基表面的菌落略有不同。 六、实验结果 固体培养基褪色说明土壤中存在可以使染料脱色的微生物，具体什么微生物有待进一步的验证。 七、实验讨论 1、实验应注意高压灭菌时需要有人看管，时刻注意压力表的读数，防止发生事故； 2、在高压锅尚有压力、温度较高时不能开启排气阀，否则会因为压力骤降而造成培养基溢出。 八、思考题解答 为什么培养基要倒置培养？ 答：为了防止可能出现的冷凝水滴入到培养基中引入杂菌或者影响观测效果。 实验二 脱色微生物的筛选及微生物菌落形态结构观察 一、实验目的 1、 掌握微生物无菌操作技术； 2、 掌握超净工作台的正确使用方法； 3、 掌握光学显微镜的正确使用方法； 4、 了解四大类微生物菌落形态的简单识别及描述； 二、实验原理 在摇床上培养过3~5d后的培养基上分布着不同的菌 落，因此需要对微生物进行筛选以选出脱色效果较好 菌株。筛选一般选取