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兔角膜内皮损伤的组织工程修复 摘要 眼球外壁的前1／6透明圆盘状结构为角膜，主要起§n保护眼球和作为屈光介 质的作用。角膜从前向后分为5层：上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内 皮层，其中，内皮层由单层扁平或低立方内皮细胞构成，通过其Nr—K+ATP酶 的“泵”功能维持角膜的“脱水状态”。成年角膜内皮细胞不能再生，细胞受损 后由邻近细胞扩大、移行填补。当细胞密度下降到其临界值(700个Imm)时， 角膜功能失代偿、角膜水肿浑浊，严重时致盲即为角膜内皮盲。目前，全世界有 1100万角膜内皮盲患者，而临床唯一有效的角膜内皮盲治疗手段是穿透性角膜 移植术，即角膜移植。但异体角膜移植存在着免疫排斥反应和供体缺乏等限制因 素。因此．研究者们致力于组织工程角膜内皮的构建。目前．常用的种子细胞包 括：角膜内皮细胞、胚胎干细胞、成伴干细胞和具有干细胞性质的成体细胞：常 用的生物材料支架包括异体或异种角膜或角膜板层、天然或合成高分子材料。本 实验旨在通过以壳聚糖基水凝胶为支架、以体外培养的兔角膜内皮细胞为种子细 胞构建组织工程角膜内皮并对兔角膜内皮损伤模型进行组织工程修复，为角膜内 皮盲的治疗提供依据。 本实验主要进行了以下几方面工作： (1)壳聚糖基水凝胶的毒性研究：对太鼠氏期腹腔注射壳聚藉基水凝胶， 通过监测犬鼠一般临床状况，测定肝脏、肾脏、脾脏相关血清生化指标、脏器系 数，观察病理切片等手段，评价该水凝胶对大鼠主要脏器的亚慢性毒性；以壳聚 糖基水凝胶浸提液培养兔角膜内皮细胞，评价该水凝胶对兔角膜内皮细胞的毒 性。(2)兔角膜内皮细胞培养基的优化：以含有几种壳聚糖衍生物的条件培养基 培养兔角膜内皮细胞，通过定性观察和定量评价．筛选出能够在一定浓度下对兔 角膜内皮细胞的生长具有显著促进作用，且对细胞形态无明显影响的糖类，以此 优化培养基。(3)免角膜内皮损伤模型的组织工程修复：通过揭除兔角膜后弹力 层和内皮层的方式构建稳定、长久的兔角膜内皮损伤模型；以壳聚糖基水凝胶为 生物材=}：}支架、以利用优化培养基培养出的高活性兔角膜内皮细|J抱为种子细胞r 对模型免进行内皮损伤的组纵工程修复．illI术IlI[}Ill察、裂隙灯观察、角膜 内表面扫描电镜观察和角膜纵切面组织切片观察，评价该方法的可行性。 本实验得到以下结果： (”该壳聚糖水凝胶对大鼠肝脏和脾脏未表现出明显毒性作用、对大鼠肾 脏前期可引起轻微损伤，后期损伤恢复，推测为机体对承凝胶的适应反应，无蓄 积毒性：该水凝胶对兔角膜内皮细胞无毒性的结论。(2)CM—CT、CS在一定浓 度一F(50--100“g／mL)对兔角膜内皮细胞的生长具有显著促进作用，且对细胞形 态无咀显影响；以一定浓度混合后，混合耱的促细胞生陡作用具有协同效应。(3) 行角膜内皮损伤模型的建立和修复12周后．一半实验组模型兔术限恢复透明， 镜下观察有单层新生角膜内皮、细胞呈多边形。 综上，本实验可得出以下结论：该壳聚糖基水凝胶适于作为组织工程角膜内 皮的生物材料支架使用；利用含CM．cT、cs的优化培养基培养兔角膜内皮细胞 可明显促进其生长；利用壳聚糖基水凝腔包封兔角膜内皮细胞对角膜损伤模型兔 进行组织工程修复的方法具有一定可行性。 关键词：壳聚糖基水凝胶：免角膜内皮细胞：壳聚糖衍生物：组织工程角膜内皮 Ti r ofrabbitGotnealendotheIa SSUe—engineeredrepai i njury Abstract The oftheouterwallofthe nansparentdisc-shapedstructure,one—sixth eyeball， the andasa mediumComeaisa isthecomeaIt role refractive plays ofprotection five-layers endotheliumEndotheliumisof