基因文库构建及酵母双杂交技术.pptVIP

靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 （1）BD-plasmid P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。 筛选标志：TRP 核定位信号是GAL4本身的一部分 ADH：Alcohol dehydrogenase （2）AD-plasmid 外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 筛选标志：LEU2 核定位信号是SV40的T抗原的序列 4.6 酵母双杂交的实验过程 4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424） 4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 报告基因：HIS（合成组氨酸） 4. 6.4筛选观察 （1）存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。 Trp- Leu- 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。 （2）蛋白结合选择 His- Trp- Leu- * * * * * * * * 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体 ：?载体系列（ 容量为 24 kp ）、cosmid载体（容量为 50 kb ）、YAC（ 容量为 1 Mb ）、BAC（ 容量为 300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 ?噬菌体载体构建基因组文库 2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 ?? 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 PolyAT tract mRNA的分离纯化过程 2.2反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)； 应选用甲基化dCTP； 应保证所获得双链cDNA的方向性。 cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 mRNA (A)n (T)12-18 (A)n (A)n (T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6 第二链合成 (A)n (T)12-18 (A)n R6 R6 R6 R6 R6 R6 (A)n (T)12-18 EcoRI EcoRI 加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级 cDNA合成完毕，准备连接 第一链合成 cDNA合成过程示意图 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 cDNA合成的分子修饰 接头及引物序列 无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTP RNaseH，DNA聚合酶I EcoRI接头，T4连接酶 XhoI酶切 完整有方向的cDNA XhoI XhoI EcoRI XhoI XhoI cD