PTG19-T载体11.pptVIP

克隆载体系列之 PTG19-T载体的制备 前 言 我们公司针对克隆载体，开发出了五种新型实用的载体，其中T克隆载体就有四种。PTG19-T载体是其中一种，该载体为高效克隆PCR产物的专用载体，Amp抗性，是一种新颖的pUC系列T载体，由PTZ19R载体改造而成。 pTG19-T 载体图谱 pTG19-T 载体多克隆位点结构 ·PTG19-T载体的特点与优点 ·多克隆位点更多的单切点，同时调整了β-半乳糖苷酶阅读框，大大方便了克隆的蓝/白斑的筛选 ·检测方便，插入位点两端独特设计了两个BamHⅠ位点，用BamHⅠ单酶切即可检测，也可用廉价的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 ·可用M13通用引物或T7通用引物进行测序 ·PTG19-T载体含有T7RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录 ·连接效率高，Control insert经克隆后，90%以上包含目的片段 主要内容 ·G364-3，G364-4质粒的大量制备 · Xcm Ⅰ酶切 · QIAGEN tip20柱纯化回收PTG19-T Vetor · PTG19-T载体质量控制 ·G364-3，G364-4质粒的大量制备 PTG19-T载体由PTZ19R载体改造而来，优化成G364-3，G364-4。 经过大量制备得到高质量的G364-3，G364-4质粒，供后续实验。 · Xcm Ⅰ酶切 Xcm Ⅰ分别酶切G364-3和G364-4质粒 酶切体系500uL，1ug质粒用酶1U 10min 20min 25min 30min 10min 15min 20min 图1：1ug质粒用酶0.5U 图2：1ug质粒用酶1U 40bp 60bp · QIAGEN tip20柱纯化回收 PTG19-T Vetor 工作原理：漂洗液Buffer QC在不同PH值或盐离子浓度下对不同大小的DNA片段的洗脱存在相关性。PH值越高或盐离子越高，DNA大片段越容易被洗脱。同时洗脱效率与柱子的使用次数相关，使用次数越多，洗脱越容易。 G364-3,G364-4经酶切后直接运用QIAGEN tip20柱纯化回收， tip20柱最大回收量为20ug 实验得知：柱使用1-2次，Buffer QC PH7.8；柱使用3-7次， Buffer QC PH7.7对PTG19-T载体的回收能达到60%。 柱使用次数 1次 4次 5次 6次 6次 7次 PH7.8 A B C PH7.7 D E F G 实例： 取3k+100bp（各约2.5ug）DNA片段进行tip20柱回收实验 本次结论：tip-20柱使用4次以上时，用Buffer QC PH7.7对3K DNA片段的洗脱回收率在70%以上；柱使用1次时Buffer QC PH7.85，回收率80%以上。 · PTG19-T载体质量控制 ·PTG19-T载体与PTG dual-T载体转化实验的比较 ·PTG19-T载体的连接转化实验 ·PTG19-T载体的连接转化实验 · 700bp和1.5kb DNA片段连接转化及自连转化 连接体系：15uL 载体与目的片段的摩尔比为1：3 自连体系中载体为180ng PTG19-T Vector 60ng 10×T4 Buffer 1.5uL T4 DNA Ligase 2uL DNA片段 2uL 补水至15uL 实验结果： 平板展示！ 700bp平板中：白斑2000个左右、蓝斑9个 1.5kb平板中：白斑1000个左右、蓝斑13个 自连平板中：蓝斑40个 ·PTG19-T载体的连接转化实验 · 连接时间长短对PTG19-T载体连接转化的影响 四个连接时间梯度，分别为10min，20min，30min，60min 连接片段为700bpDNA，采用连接MIX（2×） 实验结果：连接时间30分钟以上比连接时间20分钟以下连接效率高 平板展示 ·PTG19-T载体与PTG dual-T载体转化实验的比较 ·大片段（DNA长度2K，3K，5K）连接效率的比较 · 两种载体对700bp，1.5kb DNA片段连接效率的比较 实验结果：连接效率相当 平板展示！ ·载体稳定性 小 结 ·PTG19-T载体连接效率高，Control insert经克隆后，90%以上包含目的片段 ·检测方便，BamHⅠ单酶切或EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 ·含有T7RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录 ·可用M13通用引物或T7通用引物进行测序