TA克隆简述31.doc

生物秀论坛『中国生物科学论坛』 PCR产物的T载体克隆（一）? ? ? ? 重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。二．材料与方法1 材料外源DNA片断2 仪器、用具移液枪、碎冰3 试剂pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法连接体系如下：16连接过夜。（二）? ? ? ? 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1 材料E.coli JM109菌株2 仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3 试剂(1) CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇的Buffer W2a(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液(4) 酚；氯仿；异戊醇(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大肠杆菌感受态细胞的制备(1) 取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl 转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。(2) 4，5000rpm离心2min，去上清液。(3) 加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。(4) 4，5000rpm离心2min，弃上清液。(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4保存备用。2. 重组DNA的转化(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37预热。(2) 于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。(3) 将离心管转入42水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。(4) 在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37、150rpm温和摇振60min。(5) 将200μl 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37倒置培养过夜，