09-10-23基因工程原理9.pptVIP

第四章 目的基因的制备 4.2 目的基因的制备 直接分离法 构建基因组文库分离法 构建cDNA文库分离法 利用PCR反应扩增目的基因 化学合成目的基因 4.2.3 cDNA基因文库的构建及目的基因的分离 4.2.3.1 cDNA文库的概念 ——某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。 4.2.3.2 cDNA文库的构建过程 1. 分离细胞总RNA，并纯化mRNA。 （1）提取组织的选择 总RNA包括：rRNA（80-85%） tRNA（10-15%） mRNA（1-5%），大小不同，序列各异，种类繁多。选择高丰度组织。 高丰度mRNA组织：目的基因的mRNA占50-90%，有时可以不需要进一步纯化。 中等丰度mRNA组织 低丰度mRNA组织 例如：珠蛋白基因的mRNA——血液组织 卵清蛋白基因的mRNA——输卵管组织 胰岛素基因的mRNA——胰腺组织 （2）总RNA的提取 与DNA的提取相似。 沉淀细胞——裂解细胞——离心去残渣 ——上清液除蛋白——沉淀RNA。 （3）mRNA的纯化 Poly（A）RNA的分离 ——柱层析Oligo（dT） mRNA分级： 梯度离心，电泳， mRNA转译活性鉴定 ——无细胞体系（兔网织红细胞裂解物） ——蛙卵系统（非洲爪蟾卵母细胞系统） 2.以mRNA为模板，合成cDNA第一条链 Oligo（dT）引导的cDNA合成 随机引物引导的cDNA合成法：利用多个由6-10个核苷酸组成的随机引物。（182页） 3. 双链cDNA的合成 （1）自我引导合成法 （2）大肠杆菌RNaseH降解取代法 （3）Oligo（dG）寡聚引物引导法合成双链DNA （4）PCR法 （5）载体引物引导合成法 （6）固相支持法 （3）Oligo（dG）寡聚引物引导法合成双链DNA：用Oligo（dG）直接引导合成第二条链。 （4）PCR法 用PCR法进行基因克隆的优点： 适合于不同时期基因表达的变化研究 不用纯化mRNA，避免遗传信息丢失 可以得到完整末端 RACE（rapid amplification of cDNA ends） ——以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，用PCR技术扩增出从某个特定位点到3‘或5’末端的核苷酸序列。 包括：3‘RACE和5’RACE。 ——特定位点指cDNA基因内位点，其引物叫基因特异性引物（gene-specific primer）GSP。 （5）载体引物引导合成法 （6）固相支持法 4. 将合成的双链cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，导入大肠杆菌增殖 以质粒为载体构建cDNA文库：189页 重组子鉴定、文库扩增方便。克隆效率低。 以噬菌体为载体构建cDNA文库 克隆效率高，重组子鉴定、文库扩增繁琐。 4.2.3.3 mRNA丰度与cDNA文库大小的关系 cDNA文库大小的理论估算： 实际cDNA基因文库大小： N=ln（1-P）/ ln（1-f） N：cDNA基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：mRNA丰度与总mRNA比值 例如，丰度3500时，N是650个。 4.2.3.4 cDNA克隆的优越性 cDNA克隆以mRNA为材料，适合RNA病毒的研究 cDNA文库的筛选比较简单易行 目的基因筛选的假阳性率低 可以克隆在细菌中表达的基因 可用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究 4.2.4 利用PCR反应技术扩增目的基因 （1）套式PCR（nested PCR） （2）反向PCR（inveerse PCR） （3）不对称PCR（asymmetric PCR） （4）锚定PCR（anchored PCR） （5）长程PCR（long and accurated PCR） （6）反转录PCR（RT-PCR） （7）锅柄PCR（panhandle PCR） （8）Alu PCR （1）套式PCR（nested PCR） 2对引物扩增同一样品，其中1对引物处于另一对引物内。 分内部引物、外侧引物 先用外侧引物扩增长DNA序列，以此为模板，以内部引物扩增出适当的DNA片段。 特异性强 （2）反向PCR（inverse PCR） 根据已知DNA序列设计2个引物，扩增出这已知靶序列的两端未知DNA片段。 过程：首先用RE消化待侧DNA片段，用连接酶使片段自我环化，酶切已知序列，并用已知DNA序列设计2个引物扩增出这已知靶序列的两端未知DNA片段。 （3）不对称PCR（asymmet