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最新不可忽视的细节 -血液基因组提取248.ppt
DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 * rhrth 基因组提取方法 溶液盐析法:无需酚氯仿,样本量灵活可变,得率高 硅胶膜吸附法:利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸 磁珠法:独特包埋的磁珠,在一定条件下对核酸具有很强的亲和力,而当条件改变时,磁珠释放吸附的核酸,能够达到快速分离纯化核酸的目的。 传统酚氯仿法:传统方法,抽提时间长,成本低。但酚氯仿有毒,危害身体健康。 * rhrth DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 * rhrth 样本保存和前处理-抗凝血液 保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周;-20℃保存一个月;-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。 * rhrth 样本保存和前处理-非抗凝血 保存 非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月;-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理1. 冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解,轻柔颠倒混匀。 2. 血凝块取出后先采取机械破碎的方法(例如:放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆)将血凝块破碎,然后再根据自己的实验取适量样本。 血凝块前期破碎程度越高,提取基因组就越容易! * rhrth 样本保存和前处理-白膜层 保存 全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2. 冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解,轻柔颠倒混匀。 3. 虽然得到的是白膜层,但是会有少量红细胞存在,所以红细胞裂解液 还是必要的,但用量减半。 4. 采用白膜层提取核酸时,所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即:1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。 * rhrth 样本保存和前处理-血清/血浆 保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究,例如:肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。 样本前处理1. 冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解,轻柔颠倒混匀。2. 血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3. 只需100-200ul样本,基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。 * rhrth 样本保存和前处理-微量血液/干血点/羊水/胸水 保存 微量血液:抗凝血液-20或-70℃保存;干血点:干燥后室温或4℃保存;羊水: -20或-70℃保存。 样本前处理1. 微量血液处理同抗凝血液,不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。3. 羊水/胸水提取时先离心得到沉淀,再进行裂解提取核酸。 * rhrth 样本保存和前处理-口拭子/漱口水 保存 口拭子:干燥后室温保存漱口水:4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存 样本前处理1. 拭子将拭子棉头剪入到离心管里,加入缓冲液直接进行提取。2. 有些拭子的棉头剪不下来,可以将拭子在生理盐水里漂洗几次,离心得到沉淀再进行核酸提取。3. 漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。 * rhrth DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 * rhrth 基因组提取流程 加入吸附柱 缓冲液漂洗 DNA洗脱收集 样本裂解 纯化去蛋白 沉淀核酸 洗涤去盐 溶解DNA沉淀 样本裂解 溶液法(盐析法) 吸附柱法 * rhrth 红细胞裂解 哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富,所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式: 采用红细胞裂解液进行裂解(通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解). 采用细胞裂解液进行裂解(TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积),细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞,得到的为细胞核沉淀,更方便基因组DNA的提取。 红细胞裂解充分的现象:得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解,注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。 * rhrth 核细胞裂解 如果有裂红的步骤,请尽量将上清去除再加
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