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生物素化标记—用于蛋白、抗体的检测和纯 化 原创2017-03-16 生物素是水溶性B 族维生素，以前称为维生素H 或辅酶R。它是羧化酶的辅酶，其 与缬氨酸、脂肪酸、异亮氨酸等的合成有关。 连接各种反应基团的生物素被用来标记蛋白质或抗体。生物素标记的蛋白或抗体可 用链霉素耦联的HRP 或磁珠进行检测或纯化。 生物素化试剂（Biotinylation reagents）包含3 种： a. 伯胺反应性生物素化试剂 （Amine biotinylation reagents）； b. 巯基反应性生物素化试剂 （Sulfhydryl biotinylation reagents）； c. 羰基反应性生物素化试剂 （Carbonyl biotinylation reagents）。 一、伯胺反应性生物素化试剂 1.分类 伯胺生物素化试剂基于水溶性分为两组：NHS-酯（NHS-esters ）和磺基-NHS- 酯（Sulfo-NHS-esters ）。 2.特点 NHS-esters 的特点： • 蛋白质标记 — 生物素化抗体或其它蛋白质，用于检测或纯化； • 细胞内标记 — 膜渗透性，可用于标记细胞内部； • 胺反应性 — 与伯胺（-NH2）反应，例如赖氨酸的侧链或N 端伯胺； • 溶解性 — 水不溶性，必须溶解在DMSO 或DMF 中，然后在水溶性缓冲液中 进一步稀释。 Sulfo-NHS-esters 的特点： • 蛋白质标记 — 生物素化抗体，用于固定、纯化或检测； • 细胞表面标记 — 不穿透质膜，仅生物素化细胞的表面蛋白； • 胺反应性 — 与伯胺（-NH2）反应，例如赖氨酸的侧链或N 端伯胺； • 溶解性 — 易溶于水，可用于不能耐受有机溶剂的应用。 3.应用举例 A. NHS-SS-biotin 标记细胞表面蛋白 Western blots of ErbB4 associated with the beads as well as in neuron lysates. NRG1 诱导神经元中的ErbB 内化。细胞表面蛋白在4 ℃下用NHS-SS-biotin 标记， 然后在37℃下进行ErbB 受体内化。表面蛋白上的剩余生物素在孵育后通过谷胱 甘肽除去。将对照和NRG1 刺激的神经元裂解，并用链霉素磁珠纯化内化的生物 素化蛋白。 B. Flag-Orail，未经处理或用衣霉素处理，用sulpho-NHS-biotin 进行表面标记 Anti-Flag immunoprecipitates were probed for biotinylated Flag–Orai1 (left) and for total Orai1 (right). Orai1 是在细胞表面表达的四跨膜蛋白，其N 和C 末端位于细胞质中。未经处理 或用衣霉素（Tu ）处理的表达Flag-Orai1 的HEK293 细胞用sulpho-NHS-biotin 进行表面标记。衣霉素处理阻止Orai1 的糖基化，使其不能转移到细胞表面，因 而不能被 sulpho-NHS-biotin 标记，用 avidin-HRP 检测不到。而未处理样品的 Orai1 位于表面，可以被sulpho-NHS-biotin 标记而被avidin-HRP 检测到。 二、巯基反应性生物素化试剂 1.分类 分为两类：生物素-HPDP （Bioti