基因工程流程之简介.pptVIP

基因工程操作流程之简介 ①查找目的基因（查阅相关资料和文献，了 解目的基因相关信息） ②根据目的基因选择质粒及细胞 ③目的基因的获取：a.从基因文库获取 b.直接从组织中获取(cDNA/DNA) 通过引物来实现特异片段的扩增（PCR），由此来获得足够量的目的基因片段 ④目的基因与载体的重组及扩增 ：酶切、酶连、转化、筛选、培养、质粒提取 以获得大量重组的质粒载体告终 ⑤表达产物的获取：重组质粒载体的转化，诱导表达，检测，产物纯化 最终得到表达产物 1 atgaagttta tcgtgtgctt cagtctactg 31 gtgctagtgg tctactcaag ccaggcacat 61 cctgtggccg aggagcagct cgtggagcag 91 gatcagcccc tagcagaggt ccaggaggtg 121 ggagtggcag aagcagctga gcccgagttg 151 cattcacgtc aaaagcgtgc cacctgcgat 181 ctgttgagca aatggaatgt gaatcacaca 211 gcctgtgctg cccattgtct cgccaagcgc 241 ttcaagggcg gctattgcaa taacaaggca 271 atttgcgtct gccgccgcta g 问：为什么有的CDS序列不是以atg开头的？ XhoⅠ与SalⅠ,BamHⅠ与BglⅡ互为两组同尾酶 BamHI GGATCC 质粒上 BglII AGATCT 抗菌肽上 SalI GTCGAC 质粒上  XhoI CTCGAG 抗菌肽上 引物： 3’ GGCAGATCTATGAAGTTTATCGTGTGCTT 5’ AATCTCGAGCTAGCGGCGGCAGACGCAAA 5’/3’保护碱基+酶切位点+目的基因同源片段 目的基因序列: ATGAAGTTTA TCGTGTGCTT CAGTCTACTG GTGCTAGTGG……CTATTGCAAT AACAAGGCAA TTTGCGTCTG CCGCCGCTAG PCR条件： 94℃ 5min 94℃ 30’ 72℃ 30’+30’ 72℃ 5min 质粒： IPTG诱导 分浓度梯度进行诱导：当菌液浓度 OD值为 0. 5 时 ,分别加入 IPTG至终浓度 0、 0. 1、0. 2、 0. 6、 0. 8、 1. 0、 2. 0、 4. 0mmol/L ,37℃诱导培养 3h over * 根本任务：对某一有价值的基因的产物进行高效且可控的表达 前期的资料准备过程 具体的实验操作过程 总体思路 Dgri\GH11775 antibacteria peptide ：Dgri\GH11775 ROSATTA 同尾酶 同尾酶 30cycles 跑琼脂糖胶验证 （看条带大小及亮度） 纯化，回收PCR产物（试剂盒） 再次跑琼脂糖胶验证 双酶切、酶连 目的基因： 质粒转化(常规化学转化到DH5a细胞中) 筛选（用含ap抗生素的平板进行筛选）,菌种培养 质粒提取 质粒化学转化到rosatta细胞 诱导表达 超声波细胞破碎，蛋白产物检测 ①跑PAGE胶，考染。对产物的表达量进行检测 ②用粗体物进行抑菌试验，对产物的活性进行检测 蛋白产物的分离纯化及复性（可有his-tag帮助纯化） 根据实验结果，对以上实验流程进行改进和条件优化 *