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第十二章 核酸的生物合成 一、DNA的生物合成 （一）DNA的半保留复制 推测复制时DNA的两条链分开，然后用碱基配对方式按照单链DNA的核苷酸顺序合成新链，以组成新DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。每个子代分子的一条链来自亲代DNA、另一条链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(图12-1)。 1958年Meselson和Stahl首次用实验直接证明了DNA的半保留复制。他们先使大肠杆菌长期在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长，使其DNA全部变成[15N]DNA。然后再将细菌转入普通培养基(含14NH4C1)中，并将各代的细菌DNA抽提出来进行氯化铯密度梯度离心。 此法是用每分钟数万转的超速长时间离心，使离心管内的氯化铯溶液因离心作用与扩散作用达到平衡，而形成密度梯度(即其密度从管底部向上逐渐变小)。同时，溶液中的DNA就逐渐聚集在与其密度相同的氯化铯位置处形成区带。 由于[15N]DNA比[14N]DNA的密度大，离心时就形成位置不同的区带。Meselson和Stahl发现在[15N]培养基中的细菌DNA只形成一条[15N]DNA区带。移至[14N]培养基经过一代后，所有DNA的密度都在[15N]DNA和[14N]DNA之间，说明形成了一半[15N]DNA和一半[14N]DNA的杂交分子。实验证明第二代DNA正好一半为此杂交分子、一半为[14N]DNA分子。第三代以后[14N]DNA成比例地增加，整个变化与半保留复制预期的完全一样(图12-2)。此后，又对细菌、动植物细胞及病毒进行了许多实验研究，都证明了DNA复制的半保留方式。 DNA复制开始于染色体上固定的起始点。起始点是含有100—200个碱基对的一段DNA。先是DNA的两条链在起始点分开形成叉子样的“复制叉”、随着复制叉的移动完成DNA的复制过程。细胞内存在着能识别起始点的特种蛋白质。 DNA复制可以朝一个方向，也可以朝两个相反的方向进行；其证据可以来自放射自显影实验或电子显微镜观察。用此法观察到：大肠杆菌染色体为一环形分子，复制时整个分子的形状好似字母“θ”。如用低放射性作第一次脉冲标记后，再用高放射性作短期标记，结果低活性区在放射自显影图的中间而高活性区则在两端，这说明大肠杆菌染色体的复制是朝两个方向进行的(图12-3)。在电子显微镜下也可直接观察到复制时形成的“泡”或“眼”。环形染色体多以“θ”方式进行复制；大多数生物染色体DNA的复制是双向进行的。 在迅速生长的原核生物中，第一个染色体DNA分子的复制尚未完成，第二个DNA分子就在同一个起始点上开始复制，其复制叉移动的速度约为105碱基对／min。 在真核生物染色体的不同位置上有多个起始点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有2000-3000个复制起始点(图12-4)。从这些起始点开始向相反方向复制就形成多个复制泡或复制眼，可用电子显微镜观察。真核生物的复制叉移动较慢(5×102～5×103碱基对／min)，但由于同时起作用的复制叉数目很大，真核生物染色体DNA复制的总速度比原核生物还快。例如果蝇胚胎的DNA在3min内可增加1倍，而基因组总长只有果蝇1／40的大肠杆菌染色体，复制一代却需40min。 (二)原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成） 1．DNA聚合酶I DNA复制过程中最基本的酶促反应是四种脱氧核苷酸的聚合反应。1956年Kornberg等首先从大肠杆菌中分离出催化此反应的DNA聚合酶。催化这个反应的酶现称为DNA聚合酶I(或Komberg酶)。DNA聚合酶I已高度纯化，对它进行了详细研究。它含相对分子质量为109000的一条肽链；催化DNA新链合成时需要所有四种脱氧核苷三磷酸作为底物，还需要Mg2+、DNA模板以及与模板DNA互补的一小段多核苷酸引物，酶的活性部位含有紧密结合的Zn2+。酶催化新脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3’-羟基共价结合，并从新加入的脱氧核苷三磷酸分子上释放焦磷酸，因此合成的方向是从5’端到3’端。所产生的焦磷酸随即被细胞中的焦磷酸酶分解产生无机磷酸，使聚合反应趋向完成。 脱氧核苷酸单位逐个加到引物的3’端是按照模板链的碱基顺序，遵循Watson-Crick碱基配对的原则进行的。当模板上出现一个脱氧胸苷酸残基时，新链就加上一个脱氧腺苷酸，反之也然；同样，当脱氧鸟苷酸在模板链上出现时，新链就加上一个脱氧胞苷酸，反之也然。因此DNA聚合酶所催化的化学反应产物是碱基顺序与模板链碱基顺序互补的DNA链(图12-5)。进一步的研究表明：DNA聚合酶I不但可催化DNA链的延长，也能催化DNA链的水解，即它具有从DNA分子的