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第五章 目的基因导入受体细胞 作为受体菌的原核生物 大肠杆菌 枯草杆菌: 蓝细菌 链霉菌 5.2 重组DNA分子转入原核生物细胞 5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.2.3 受体细胞的选择 5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 转化（transformation）：质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。 转染（transfection）：将外源DNA分子导入真核细胞的过程。 转导（transduction）：以噬菌体为载体，将外源DNA导入细菌的过程。 感染（infection）：利用病毒将外源DNA分子导入真核细胞的过程。 此外，还有纤维注射、电穿孔等主要用于高等动植物细胞的方法。 5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化 (transformation)——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程。 基本步骤： 细菌感受态的形成： 转化因子的吸收 整合复合物前体的形成 单链DNA转化因子的整合 转化子的形成 制备感受态细胞： CaCl2 Buffer，0℃15min后，离心，再加入CaCl2 Buffer， 4℃12-14小时，获得感受态细胞。 DNA分子转化感受态细胞： 在感受态细胞中加入重组DNA，冰浴30min后 42℃水浴2min， 37℃5min 加入LB培养基， 37℃震荡1小时，铺平板筛选转化子。 （2）电穿孔转化法 适用于将DNA导入细菌或真核细胞，转化效率可达109-1010 /μg DNA。 原理：利用高压电脉冲作用，在细胞膜上产生可逆的瞬间通道，促使外源DNA吸收。当电场强度和脉冲时间的组合可导致50 %-70 %细菌死亡时，转化效率最高。脉冲过后，膜上的微孔复原，在培养基中生长数小时后开始增殖 5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 制备包装物 体外包装 侵染大肠杆菌 筛选重组噬菌斑 5.2.3 受体细胞的原则 限制系统缺陷菌株作为受体细胞 体内同源重组缺陷型 易于转化或转导的受体细胞 有明显的选择性差异 感染寄主缺陷型。 5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 5.2.4.1 重组DNA分子导入植物细胞 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 ——外植体的选择： （274页） ——程序： 外源DNA——重组到农杆菌DNA上——侵染植物外植体（T）——共培养2-4天——脱菌培养——筛选重组子。 转化方法 叶盘法 整体植株接种转化法 原生质体共培养转化法 悬浮细胞共培养转化法 DNA直接转移法 ——多聚物介导法：PEG，转化率10-5- 10-6， 优点是对细胞伤害少，转化体易于筛选 缺点是转化率低，原生质体再生困难。 ——电穿孔：电脉冲打孔，与PEG合用 优点是转化率提高10倍 缺点是对原生质体损害 ——激光束穿孔：激光打孔。 优点是操作简单，转化率高，适用于各种组织 缺点是昂贵的设备，技术条件要求高，稳定性和安全性差。 ——显微注射法：直接把外源DNA注射进受体细胞。 优点是转化率非常高， 缺点是细胞团的固定，操作繁琐，仪器昂贵。 ——超声波介导：超声波使细胞变形。 ——基因枪法：利用金属弹把外源DNA导入细胞。 优点是操作简单快速，转化率高 缺点是子弹对细胞的伤害、价格昂贵。 ——脂质体介导法： 脂质体：人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在内，并运送进细胞的物体。 优点是直接转化，转化率高 缺点是脂质体的制备繁琐。 ——花粉管通道法 5.2.4.2重组DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法：利用SV40病毒载体。 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 显微注射转基因技术 电穿孔DNA转移技术 脂质体介导法 5.3 重组子的筛选 思 考： 转化子与非转化子？ 重组子与非重组子？ 转化子与重组子？ ——转化子包括重组子和非重组子。 5.3.1遗传表型直接筛选法 5.3.2依赖于重组子结构特征分析的筛选法 5.3.3核酸分子杂交检测法 5.3.4免疫化学检测法 5.3.5转译筛选法 5.3.6亚克隆法 5.3.7插入失活法 5.3.1遗传表型直接筛选法 5.3.1.1根据载体选择标记初步筛选转化子 （1）抗药性筛选： Amp、Kan、Cmp、Tet、Str等， ——用于重组质粒DNA分子转化子的筛选。 缺点是筛选出来的转化子既有重组子，又有非重组子。 （3）插入表达筛选：利用外源基因的插入激活筛选标记基因的表达。 例如：pTR262质粒载体： （4）显色互补筛选： β-半乳糖苷酶的α-肽链和互补菌JM101产生完整的β-