99基因工程原理.pptVIP

3.1质粒克隆载体 3.2 病毒克隆载体 3.2.1 λ噬菌体载体 3.2.2 cosmid克隆载体 3.2.3 M13噬菌体克隆载体 3.2.4 CaMV克隆载体 3.2.5 烟草化叶病毒（TMV）克隆载体 3.2.6 SV40克隆载体 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 病毒克隆载体 噬菌体克隆载体 相关概念： 溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。 溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。 温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。 烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。 溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。 3.2.1 λ噬菌体克隆载体 与构建克隆载体相关的λ噬菌体性质 λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。 选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 构建λ噬菌体克隆载体的基本策略和技术路线 （1）切去λDNA的非必需的部分，在非必需区内制造克隆位点。如：EcoRI。 必要基因：参与噬菌体生命周期活动，对噬菌体的生长和噬菌斑的形成是必需的（左、右区段）。 非必要基因：被外源基因取代后不影响噬菌体的生命功能的基因（中间区段） （2）在λDNA的非必需内加入标记基因。 Spi+和Spi-表型： λDNA的red和gam基因控制λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性细胞中生长，是Spi+表型；当该片段被外源DNA取代后， Spi-表型，可以生长。 ——置换型载体（replacement vector） β半乳糖苷酶-lacZ片段： 在非必需区插入lacZ片段，获得β半乳糖苷酶插入失活标记。 ——插入型载体（insertion vector） 如Charon系列载体，Blattner等人在1977年构建的噬菌体载体。 （3）消除? 噬菌体基因组多余的限制性核酸内切酶识别位点。 点突变，基因组置换及缺失 （4）建立重组λDNA分子体外包装系统。 体外包装——试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部组装过程。 λ噬菌体DNA的包装限制问题 包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为51kb-28kb=23kb。实际为15kb。 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。 λ噬菌体克隆载体的应用 ——构建cDNA文库 转染作用（transfection）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过程。 重组λDNA分子的体外包装 见教材111页 3.2.2 cosmid克隆载体 ——cosmid = cos site-carrying plasmid 构建cosmid克隆载体的策略 具有噬菌体载体的高转导性能：保留cos位点以及包装的相关基因。 结合质粒载体的自我复制性能，改变质粒载体携带外源DNA小的缺点。 cosmid克隆载体的特征 环型DNA分子，大小不超过36kb。 具有质粒性质，可以转化大肠杆菌，并自我复制，有RE切点。 有cos位点，提供包装的条件。具有λ噬菌体的特性。在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的粘粒DNA分子，能按照λ噬菌体DNA同样的方式环化。 承载大的外源DNA片段。见教材113页。 使用cosmid克隆载体的基本程序 3.2.3 M13噬菌体克隆载体 M13 DNA 环型单链DNA，（+） 长6.4kb， 分10区和1间隔区 间隔区内可以插入外原DNA。 M13 DNA 的复制和M13噬菌体的增殖 （1）M13噬菌体的生命周期： M13噬菌体只感染带有F性须的大肠杆菌。 构建M13噬菌体克隆载体的策略和途径 在基因间隔区加入选择标记：lacZ’片段 加入合适的RE切点（MCS） M13克隆载体的应用 具有lacZ’片段和多克隆位点，有效的克隆和筛选。 M13载体是成对出现的。 用M13 载