酶工程第七章 -第十章.ppt

第七章 核 酶 （Ribozyme）工 程 核酸 1869年瑞士科学家Miescher发现核酸 1944年Avery等证明DNA是遗传的物质基础 1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构说 Ribozyme的发现 80年代初，Cech 和 Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能，从而改变了生物催化剂的传统概念。共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。 经大肠杆菌RNA聚合酶在细胞外转录出的该rRNA前体也能进行自我剪接反应。 因此Cech提出RNA具有酶催化活性这一新概念，并把这种具有酶催化活性的RNA命名为ribozyme。 异议：认为核rRNA 前体不是真正的生物催化剂。 （1）它只是自身催化，而不能催化其他分子进行反应； （2）催化剂在反应前后应无变化，而该rRNA前体在反应中释放一段长413nt的IVS，其本身变成成熟的rRNA且不再具有催化能力 Cech的观点： （1）在没有任何蛋白质和ＡＴＰ的情况下，该rRNA前体自我剪接成rRNA这个事实是不能否认的； （2）该rRNA前体自我剪接与其自身结构关系密切，高温、高浓度变性剂以及与ＩＶＳ互补的寡聚脱氧核苷酸等都能使它的自我剪接活力丧失； （3）Ｌ—１９ＩＶＳ不能催化分子内反应，但它却能催化其他ＲＮＡ分子发生多种分子间反应； （4）Ｌ—１９ＩＶＳ具有高度的底物专一性，而且服从米氏动力学规律。 （二）Altman 的工作 (1)１９７８年Altman发现其密度介于蛋白质和ＲＮＡ之间，进而证明该酶由蛋白质（Rnase P—蛋白质）和ＲＮＡ（Rnase P—ＲＮＡ）两部分组成； (2) 大肠杆菌的Rnase P—ＲＮＡ称ＭＩＲＮＡ（３７７nt, 77%），Rnase P—蛋白质称Ｃ５蛋白(119aa, 23%) (3) ＭＩＲＮＡ与Ｃ５在体外可进行重组装； (4) 提高Ｍg2+浓度，可提高Rnase P活性，同时在高Ｍg2+浓度下，ＭＩＲＮＡ单独就具有催化活性。 (5) 多胺类、聚乙二醇等也能提高Rnase P催化活性。 结论：ＭＩＲＮＡ发挥催化活力，Ｃ５、Ｍg＋、多胺类、聚乙二醇的作用是维持ＭＩＲＮＡ发挥催化活力所需的特定构象 ＭＩＲＮＡ所显示的催化活力不可能是由于蛋白质的残留造成的，实验依据如下： 1）ＲＮＡ制剂用含ＳＤＳ的苯酚抽提过； 2）用蛋白酶处理； 3）催化反应在0.1% SDS 的溶液中进行； 4）体外转录得到的ＭＩＲＮＡ或其前体同样具有催化活性 总结：ＭＩＲＮＡ是一种真正的生物催化剂。因为它符合催化剂条件，即在体外条件下能单独催化别的分子（tＲＮＡ前体）的切割反应，少量的ＭＩＲＮＡ就能使反应大大加速，且自身在反应前后不改变。 第一节天然核酶 1、剪切型核酶，这类核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶，主要包括锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP； 2、剪接型核酶，这类核酶主要包括组I内含子和组II内含子，实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。 一 锤头型核酶 路易斯（Lewis）提出了酸碱电子理论（又称路易斯酸碱理论）： 凡是能给出电子对的物质（分子、离子或原子团）为碱，凡能接受电子对的物质（分子、离子或原子团）为酸。酸碱反应不再是质子的转移而是电子的转移，是碱性物质提供电子对与酸性物质生成配位共价键的反应 HDV中的核酶的催化机制 HDV中的核酶催化机制 胞嘧啶(C76)充当广义碱，嘧啶环上的N吸引2’羟基上的质子，活化了羟基上的O，这个O亲核攻击相邻的核酸骨架上的P，经过过渡态形成磷酸内酯键，而原来核酸骨架的磷酸酯键断裂。 二 发夹型核酶 三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP) 这类核酶主要催化tRNA前体成熟过程，例如S. Altman和N. Pace两个研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5’成熟酶。 这个酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成，其中蛋白质的分子量为20kDa，M1RNA含有377个核苷酸。M1RNA单独具有全酶活性，蛋白质只是维护M1RNA的构象。 四 组I内含子(group I intron)和组II内含子(group II intron) Cech及其同事发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在体外无蛋白质参与下除掉它自身413nt内含子。这就是由组I内含子核酶催化的反应，包括两个连续的转酯反应，并且需要Mg2+或Mn2+及鸟苷(或鸟苷酸)的参与。 在组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟基O进攻5’外显子转录顺序的3’-P， 。 形成一个带突环的内含子转录顺序-3’外显子转录顺序分子，其中第一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯键与内含子转录顺序的A相连。